中性粒细胞膜工程人参根来源的外泌体负载 miRNA182-5p靶向NOX4/Drp-1/NLRP3信号通路以减轻脓毒症急性肺损伤

引用格式：Ma C, Liu K, Wang F, et al. Neutrophil membrane-engineered Panax ginseng root-derived exosomes loaded miRNA 182-5p targets NOX4/Drp-1/NLRP3 signal pathway to alleviate acute lung injury in sepsis: experimental studies. Int J Surg. 2024;110(1):72-86. Published 2024 Jan 1. doi:10.1097/JS9.0000000000000789

研究的目的是制备中性粒细胞膜工程人参根源性外泌体（N-exo）并研究N-exo-miRNA 182-5p在脓毒症引起的急性肺损伤（ALI）中的作用机制。

通过差速离心分离人参根来源的外泌体，对其进行中性粒细胞膜工程，从而得到N-exo。通过电穿孔技术将miRNA182-5p转入N-exo中，得到N-exo-miRNA 182-5p，采用脂多糖LPS建立脓毒症ALI体内外模型，评价N-exo-miRNA 182-5p的抗炎作用。结果显示：与exo相比，N-exo中miRNA182-5p的水平显着增加。,实验结果表明，N-exo-miRNA 182-5p通过体内外靶点调节NOX4/Drp-1/NLRP3信号通路显着改善ALI。

总之，研究制备了一种新型工程化外泌体（N-exo和N-exo-miRNA 182-5p），通过靶向调控NOX4/Drp-1/NLRP3信号通路，显着改善脓毒症中的ALI，为脓毒症的ALI治疗提供了新的思路和方法。

脓毒症是宿主对感染反应失调引起的一种多器官功能障碍,严重威胁人类健康。当脓毒症发生多器官衰竭时，肺部非常容易受到损伤。引起ALI的原因有很多，包括感染、血管疾病、药物作用、休克、嗜酸性粒细胞性肺炎、免疫介导的肺出血和血管炎、放射性肺炎等。虽然目前的支持治疗、呼吸机和适当的抗生素可以在一定程度上缓解病情进展，但临床死亡率仍高达25%~40%。因此，寻找治疗脓毒症ALI的有效方法非常重要。

MicroRNA（miRNA）是一类内源基因，参与动植物转录后基因表达的调控。MicroRNA通过三种方式作用于靶基因，一是切断靶基因的mRNA分子，二是抑制靶基因的翻译，第三是结合抑制。有文献研究表明miRNA182-5p是脓毒症及其并发症的重要调节因子，它也是脓毒症早期诊断的生物标志物。

外泌体（exo）具有独特的形态和组成特征，其中携带了母细胞的蛋白质、脂质、DNA、非编码RNA等特征生物分子，具有天然的生物学特性和良好的生物相容性。近年来，外泌体的研究发展迅速，但植物外泌体的研究还处于初步阶段，有研究表明人参因其抗癌、抗炎、抗氧化等药理作用，关于人参根中皂苷、多糖等成分的研究较多，但这些成分的生物利用度很低。为了解决这一问题，在植物制剂的研究中，逐渐将重点放在新型药物递送系统的开发上，如脂质体、外泌体、纳米颗粒等。因此，本研究的目的是制备中性粒细胞膜工程人参根源性外泌体（N-exo）并研究N-exo-miRNA 182-5p对ALI的影响。

3.1脓毒症患者与健康人血浆miRNA差异分析

为了利用miRNA芯片检测ALI脓毒症患者与健康人血浆miRNA的差异。首先从人参根中提取并分离出外泌体(图1A、B)。之后检测了12个在ALI脓毒症患者和健康人中差异表达的miRNAs，其中miRNA182-5p则显著下调水平最高。因此，miRNA 182-5P是此次研究的重点(图1C)。为进一步证实ALI脓毒症患者血浆中miRNA182-5p的表达下调，采用聚合酶链式反应技术检测了ALI脓毒症患者和健康人血浆中miRNA182-5p的表达。结果表明，ALI脓毒症患者血浆中miRNA182-5p的表达明显低于正常人(图1D)。

3.2 搜索 miRNA 182-5p 靶基因

首先使用miRBase和Targetscan软件进行生物信息学分析，在NOX4 mRNA中发现了miRNA 182-5p的潜在靶标（图2A）。

继续为了验证NOX4 mRNA水平的变化，分别研究了ALI脓毒症患者、LPS诱导的MLE-12细胞和LPS诱导的ALI小鼠中NOX4基因的表达，结果发现，ALI脓毒症患者、LPS处理的MLE-12细胞和LPS诱导的ALI小鼠中NOX4 mRNA水平皆显著升高（图2B-D）。

之后验证了在不同条件下的miRNA182-5p表达水平，NOX4-wt + miRNA 182-5p的双荧光素酶活性显着降低，突变体组的双荧光素酶活性没有显著变化（图2E-G）。

进一步检测NOX4的表达，结果显示ALI脓毒症患者、LPS处理的MLE-12细胞和LPS诱导的ALI小鼠中NOX4的水平显着升高（图2H-J）。通过以上数据，表明miRNA 182-5p的表达与NOX4的表达呈负相关（图2K-M）。

图2

Drp-1是调节线粒体功能的重要蛋白质，通过免疫沉淀检测实验证实确认NOX4和Drp-1蛋白之间的相互结合作用（图3A-B）。

图3

3.3 N-exo与exo的对比

两者之间的对比主要是从表征、标记蛋白、两者中的miRNA对 fMLP趋化因子（N-甲酰基-l-甲硫酰基-l-亮氨酰-l-苯丙氨酸）响应结果三个方面来进行分析。

首先通过TME观察对比N-exo和exo的表征结构（图4A），通过NTA粒径分析N-exo的纳米粒子追踪分析(图4B)。之后通过western blot检测exo标记蛋白的表达，结果显示CD63、CD9和TSG101高表达，发现N-exo与exo表面标志物的特征一致(图4C)。最后分别检测了添加以及未添加fMLP情况下，N-Exo-miRNA182-5p 和 Exo-miRNA182-5p的反应，结果表明未添加fMLP时发现两者之间没有显著差异 (图4D)。但是添加fMLP时发现miRNA 182-5p的水平显着高于没有fMLP的水平 (图4E)。

图4

3.4 N-exo-miRNA 182-5p 对脓毒症ALI小鼠氧化应激的影响

为了继续验证N-exo-miRNA 182-5p 对脓毒症ALI小鼠的机制，分别测量了肺干湿比测量(w/d)、活性氧 (ROS)、髓过氧化物酶(MPO) 、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）的检测指标。

与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显着降低了w/d、ROS和MPO的水平。而与 N-exo-NC 相比，N-exo-miRNA 182-5p 更显着降低 w/d、ROS 和 MPO 水平（图5A-D）。

同样，与LPS组相比，N-exo-NC 和 N-exo-miRNA 182-5p 显着降低了MDA 水平，并增加了 SOD 和 GSH-px 的水平。而与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显着降低血清和肺中的MDA水平并增加SOD和GSH-px水平（图5E-J）。

图5

3.5 N-exo-miRNA 182-5p 对脓毒症 ALI 小鼠肺组织病理学和肺部炎症的影响

病理评估是脓毒症ALI的金指标，采用HE染色评估肺部病理变化（图6A）。与LPS组中的肺部炎症变化相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著改善了肺部炎症变化，并且与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显著改善炎症变化。

为了评价炎症反应，分别检测了脓毒症ALI小鼠血清中（图6B-D）以及肺中炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）（图6E-G）。与对照组相比，脓毒症ALI小鼠血清中和肺中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高。与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著降低血清和肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。而与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p也显著降低了血清和肺中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

图6

3.6 N-exo-miRNA 182-5p对脓毒症小鼠NOX4/Drp-1/NLRP3通路的影响

对于N-exo-miRNA 182-5p对脓毒症小鼠NOX4/Drp-1/NLRP3通路的影响，主要测定了NADPH 氧化酶4（NOX4）、动力蛋白相关蛋白 1（p-Drp-1）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）和白介素-1β（IL-1β）的水平。

与对照组相比，LPS组NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β水平升高；与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著降低NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL1β的水平。而与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显著降低NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的水平（图7A-G）。同样在肺中 NOX4 的免疫组织化学实验中，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显着降低了脓毒症ALI小鼠中NOX4的水平。而与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显着地降低了NOX4的水平（图7H）。

图7

3.7 N-exo-miRNA 182-5p对LPS 处理的MLE-12细胞氧化应激和细胞因子的影响

N-exo-miRNA 182-5p对LPS 处理的MLE-12细胞氧化应激方面主要测定了MDA（丙二醛）和GSH-px（谷胱甘肽过氧化物酶）。与对照组相比，LPS组MDA水平升高，SOD和GSH-px水平显着降低；与LPS组相比，N-exo-NC 和 N-exo-miRNA 182-5p 显着降低 MDA 水平，增加 SOD 和 GSH-px 水平；与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显着降低LPS处理的MLE-12细胞中MDA的水平并增加SOD和GSH-px的水平（图8A-C）。

N-exo-miRNA 182-5p 对 LPS 处理的 MLE-12 细胞中细胞因子方面主要测定了TNF-α、IL-1β、IL-6（肿瘤坏死因子α、白介素-1β、白介素-6）的炎性水平。与对照组相比，LPS组升高了TNF-α、IL-1β、IL-6的水平；与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著降低LPS处理的MLE-12细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平；与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p 更显著降低 LPS 处理的 MLE-12 细胞中 TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平（图8D-F）。

图8

3.8 N-exo-miRNA 182-5p 对 LPS 处理的 MLE-12 细胞中 NOX4/Drp-1/NLRP3 通路的影响

对于N-exo-miRNA 182-5p 对 LPS 处理的 MLE-12 细胞中 NOX4/Drp-1/NLRP3 通路的影响，主要测定了NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的水平。

与对照组相比，LPS组NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β水平显着升高。与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著降低了NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的水平。与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p 更显著降低 NOX4、p-Drp-1、NLRP3、ASC、Caspase-1 和 IL-1β 的水平（9A-G）。在肺中NOX4的免疫荧光实验中，与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著降低了NOX4的水平；与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显著地降低了NOX4的水平（图9H）。

图9

3.9 N-exo-miRNA 182-5p对 LPS 处理的 MLE-12 细胞线粒体功能的影响

N-exo-miRNA 182-5p对 LPS 处理的 MLE-12 细胞线粒体功能的影响，主要测定了线粒体的耗氧率（OCR）、线性形态、线粒体膜电位(MMP)三个方面。

在线粒体OCR方面，与对照组相比，LPS刺激降低了MLE-12细胞的OCR；与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 182-5p显著增加了LPS处理的MLE-12细胞的OCR；与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显着地增加了LPS处理的MLE-12细胞的OCR（图10A-B）。

在用共聚焦显微镜观察线粒体形态方面，与对照组相比，内毒素组大鼠肝细胞线粒体百分率明显增加；与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA182-5p显著增加线粒体线性形态；与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA182-5p更显著地增加了线粒体线性形态(图10C)。

在线粒体MMP方面，与对照组相比，LPS组MMP显着升高；与LPS组相比，N-exo-NC和N-exo-miRNA 1825p显著降低MMP；；与N-exo-NC相比，N-exo-miRNA 182-5p更显著降低MMP（图10D）。

图 10

脓毒症中ALI的病理机制较为复杂，目前，脓毒症ALI的有效防治策略仍然是当前的重点和难点问题。在这项研究中，制备了一种新型工程外泌体 (N-exo) 和 N-exo-miRNA 182-5p 来治疗脓毒症中的 ALI。发现N-exo-miRNA182-5p通过抑制Nox4/Drp-1/NLR3信号通路显着改善脓毒症中的ALI。该研究为脓毒症ALI的临床治疗提供了一种新的治疗方法。

但本研究存在一定局限性：（1）ALI脓毒症患者样本量较小，后期需要大规模研究。(2)本研究仅建立了LPS诱导的脓毒症ALI模型，未建立盲肠结扎诱导的脓毒症ALI模型。(3)本研究未对脓毒症ALI中的NOX4进行敲除和沉默。

编辑：李昕洋

排版：郑雅蔓

初审：陈波

审核：郭永明