肿瘤免疫中的“三折叠”：p53-IL-34-CD36信号轴介导的免疫逃逸

今天小编和大家分享一篇近日由 中国科学技术大学魏海明教授实验团队 发表在 《Immunity》 上的一项研究。该研究揭示了在p53突变的肝癌模型中，肿瘤干细胞会过度分泌IL-34，通过IL-34-CD36信号轴调控巨噬细胞的脂肪酸代谢过程，使得肿瘤相关巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，引发T细胞免疫抑制，最终导致肿瘤免疫逃逸。研究中涉及的相关机制请见图1所示。

图1：p53失活引发的IL-34-CD36信号通路作用机制

一、主要结果

1、“折叠第一面”--p53突变导致肿瘤干细胞分泌IL-34增多，促进肿瘤进展

为了理解p53在肿瘤微环境中的作用，作者使用CRISP-CAS9的基因编辑技术生成p53缺陷（Trp53null）以及野生型（Trp53wt）的小鼠肝癌模型，并对荷瘤小鼠的肿瘤进行RNA测序分析。作者注意到IL-34在Trp53null的小鼠模型中更高表达且与Trp53WT小鼠模型差异显著，这一现象也在qPCR和ELISA实验中所证实。

为进一步理解肿瘤微环境中，p53突变影响了什么细胞分泌IL-34增多？作者使用单细胞核测序技术（snRNA-seq）分别对Trp53null和Trp53wt的肿瘤进行检测，分析发现了肿瘤干细胞（CSCs）在p53突变后会上调IL-34的表达。多色免疫染色实验也证实IL-34和CSCs标志物EpCAM在p53突变的肝癌中大量聚集表达。

IL-34对于肿瘤微环境又有什么影响呢？作者在IL-34缺陷（IL-34-/-）的小鼠自发肝癌肿瘤模型中发现，IL-34的过表达会促进肝癌的进展。 这些结果表明IL-34在p53突变诱导的肿瘤进展过程中具有重要的促进作用（图2）。

图2：p53突变使得CSCs分泌高水平IL-34促进肿瘤增长

2、“折叠第二面”--IL-34通过CD36促进TAM细胞的脂肪酸摄取，使其向M2型巨噬细胞极化

IL-34对于调控单核细胞增殖，生存具有重要意义[1]。作者通过单核细胞测序数据分析已然发现在p53突变的小鼠肝癌模型中IL-34和巨噬细胞同时表现出相较p53未突变的肿瘤模型更高的增长比例。之后通过10x空间转录组测序，作者发现单核来源巨噬细胞（MDMs）相关基因的表达分布围绕在IL-34阳性的细胞周围。多色免疫染色实验进一步证实了这一结论。

此外，研究者使用BODIPY脂肪酸探针对TAM中的脂肪酸进行检测，来自Trp53null肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）比来自Trp53WT肿瘤的TAMs吸收了更多的脂肪酸，细胞内形成了更多的脂滴，TAMs泡沫化程度更高。此外，研究人员使用IL-34处理体外培养的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），发现IL-34会显著增加了细胞内脂肪酸的含量，并促进了脂滴的形成。 这些结果表明p53突变肿瘤模型中的TAM脂肪酸代谢重编程，形成类似于泡沫状巨噬细胞（图3）。

IL-34如何促进脂肪酸在TAM中累积呢？作者分别给予体外培养的BMDMs细胞IL-34过表达和正常处理两种处理方案，结果发现IL-34过表达的BMDMs细胞中会累积更多的脂肪酸。不同处理后的BMDMs的RNA-seq分析结果表明，CD36与IL-34的分泌密切相关。qPCR和流式细胞分析也证实了这一结论。CD36是与细胞中长链脂肪酸提取密切相关的蛋白。当使用CD36抑制剂（Sso）处理的时候，IL-34促进BMDMs细胞的脂肪酸提取这一过程受到抑制，表明IL-34对巨噬细胞的影响是通过CD36而发挥作用的。

有研究表明IL-4会使得巨噬细胞的脂肪酸氧化（FAO）代谢重编程，进而极化为M2型巨噬细胞[2, 3]。作者认为IL-34可能也能通过这一途径诱导巨噬细胞重编程。作者发现，过表达IL-34处理的BMDMs细胞会上调表达Mrc1，Arg1等M2型巨噬细胞标志分子；而当使用FAO抑制剂（Eto）或Sso处理后，巨噬细胞并不会朝向M2型巨噬细胞极化。 这些结果表明IL-34会通过CD36促进巨噬细胞的FAO重编程过程，并影响M2巨噬细胞的极化（图4）。

图4：IL-34 通过 CD36 促进脂肪酸吸收，并诱导巨噬细胞 向M2 型极化

3、“折叠第三面”—p53突变肿瘤模型中M2型巨噬细胞介导的肿瘤免疫逃逸

IL-34影响TAMs的重编程这一过程，对于肿瘤进展过程中的免疫系统又有什么影响呢？作者发现在不控制小鼠脂质摄取的情况下，p53缺陷会加速肿瘤进展，而p53和IL-34同时缺陷时小鼠的肿瘤增长会受到抑制。当控制了脂肪酸摄取时候，p53介导的肿瘤进展过程不会因为IL-34的表达而发生影响。这些实验结果表明IL-34影响了巨噬细胞脂肪酸代谢重编程，进而促进肿瘤的免疫逃逸。

巨噬细胞会通过抑制T细胞功能介导肿瘤细胞的免疫逃逸。在p53缺陷的模型中，作者也发现了T细胞免疫抑制相关分子的上调表达，以及毒性分子IFN-γ和TNF-a下调表达。这些结果表明P53缺陷的肿瘤模型中T细胞处于免疫功能耗竭状态。

为了进一步明确TAM细胞在p53缺陷导致T细胞免疫耗竭中的作用，作者分选出脾脏T细胞与BMDM细胞以及p53缺陷或IL-34缺陷的肿瘤细胞共培养。结果表明，p53缺陷或者IL-34过表达均会使得T细胞比例降低，同时上调表达PD-1抑制性受体，下调表达IFN-γ和TNF-a活化受体。

在巨噬细胞中敲除CD36的条件性敲除小鼠肿瘤模型中，与巨噬细胞未敲除CD36的小鼠相比，肿瘤的增长受到抑制，且肿瘤浸润的T细胞比例显著增加。然而，当小鼠被注射CD8抗体时，其肿瘤的生长与对照组之间并未表现出明显差异。 这些结果表明IL-34-CD36信号轴在重塑TAM巨噬细胞极化过程中会抑制T细胞功能，进而介导肿瘤免疫逃逸（图5）。

图5：IL-34 调控的 TAMs 抑制 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，促进肿瘤免疫逃逸

二、讨论与总结

p53作为一种重要的肿瘤抑制蛋白，在调控细胞周期，促进DNA修复和诱导细胞凋亡过程中具有重要作用。p53突变常见于多种癌症当中，但更多的研究关注于其在肿瘤细胞当中的影响，往往会忽视肿瘤细胞上的p53突变对于免疫细胞的直接影响。

在这项研究中，作者首次发现在p53突变的肝癌中，肿瘤干细胞会上调表达IL-34，驱动巨噬细胞脂肪酸代谢的CD36表达，引发巨噬细胞脂肪酸代谢重编程以及向M2型巨噬细胞极化，抑制T细胞免疫功能，最终导致肿瘤免疫逃逸。这一过程对于研究人员深入了解肝癌的免疫逃逸具有重要意义。然而，肿瘤干细胞在分化过程中可能会丧失IL-34的表达，这表明可能还有其他细胞参与这一通路。此外，关于肝癌的结论是否可以推广到其他癌症中，仍需进一步验证。

参考文献

[1] LUO W, ZENG Z, JIN Y, et al. Distinct immune microenvironment of lung adenocarcinoma in never-smokers from smokers [J]. Cell Rep Med, 2023, 4(6): 101078.

[2] VATS D, MUKUNDAN L, ODEGAARD J I, et al. Oxidative metabolism and PGC-1beta attenuate macrophage-mediated inflammation [J]. Cell Metab, 2006, 4(1): 13-24.

[3] HUANG S C, EVERTS B, IVANOVA Y, et al. Cell-intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages [J]. Nat Immunol, 2014, 15(9): 846-55.