Mol Cell|实现小鼠体内高效编辑!李大力团队开发基于IscB的高活性迷你基因编辑工具

在过去十多年里,以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑及其衍生技术得到了快速发展,使人们能够更加精准高效的对基因进行改造,为更好的理解生命过程、开发精准的基因疗法提供了新的可能性。首个基于CRISPR/Cas9技术的离体 (ex vivo) 基因编辑疗法Casgevy已于2023年底获批上市,用于地贫和镰贫的基因治疗 【1】 ;通过肝脏靶向的LNP-mRNA递送的方式,在体 (in vivo) 基因疗法也取得了喜人的临床试验数据。基因编辑技术已经迈进了临床应用的时代。然而,靶向于肝脏以外器官的在体基因编辑治疗仍存在很大的瓶颈。目前适用于肝外基因递送的载体主要是腺相关病毒 (Adeno-associated viruses, AAV) ,然而其包装上限约4.7kb,单个载体难以递送Cas9等核酸酶及其衍生编辑系统。因此寻找小尺寸、高效率的基因编辑系统对于实现安全高效的体内递送具有重要意义。近年来,陆续报道了一系列小型Cas蛋白,包括小型Cas12f蛋白 【2-4】 、其进化上的祖先TnpB 【5, 6】 以及真核同源物Fanzor 【7, 8】 。然而,由于Cas12f家族只有一个RuvC结构域,难以用于碱基编辑、先导编辑等依赖于缺口酶的衍生技术。

2021年,张锋团队通过对测序数据有针对性的挖掘和分析,发现由IS200/IS605转座子超家族编码的IscB核酸酶,也具有能够切割DNA链的HNH和RuvC结构域 【9】 。作为Cas9可能的进化祖先,IscB普遍只有约400-500个氨基酸 (仅为SpCas9氨基酸长度的三分之一左右) 利用一段非编码RNA (ωRNA) 引导蛋白识别切割DNA。因此,IscB更有潜力构建缺口酶,与胞嘧啶脱氨酶 (APOBEC) 、腺苷脱氨酶 (TadA) 或逆转录酶 (RT) 融合,构建可由单个AAV完整包装的迷你碱基编辑器 (BE) 或先导编辑器 (PE) ,具有极大的临床应用潜力。然而,IscB在哺乳动物细胞中的活性非常有限。以OgeuIscB为例,其在HEK293FT细胞中编辑效率不到5%。因此,能否通过工程化的改造提高IscB的基因编辑活性,达到与Cas9相当的活性是需要解决的首要问题。
2024年8月2日,华东师范大学 李大力 团队在 Molecular Cell 上发表题为: Engineering IscB to develop highly efficient miniature editing tools in mammalian cells and embryos 的研究论文。 该研究综合蛋白质工程化改造、RNA结构优化、胚胎注射等技术,成功获得在人类细胞以及鼠源细胞系中具有超高编辑活性的IscB变体(eIscB-D)。 通过将IscB切口酶 (eIscB H339A 与腺苷脱氨酶 (TadA-8e) 或胞嘧啶脱氨酶 (hA3A*) 融合,开发出超高活性的迷你单碱基编辑器eiABE和eiCBE。该系统在小鼠胚胎中展现高效的体内编辑活性,可用于构建白化病等疾病动物模型。


为了提高IscB蛋白活性,研究者基于结构理性设计在关键位置引入精氨酸突变 【10, 11】 ,经过三轮迭代筛选,成功获得增强型IscB (命名为eIscB) 。eIscB相较于野生型IscB编辑效率最高可以提升22.4倍,平均编辑效率可提高7.5倍。此外,研究者通过融合一个非序列特异性DNA双链结合蛋白 (HMG-D) 提高了IscB与目标DNA的亲和力,高活性IscB (eIscB-D) 的最高编辑效率可达91.3%。在此基础上,研究者针对向导RNA进行优化改造,获得高效ωRNA (命名为eωRNA) ,且长度相较于野生型ωRNA缩短了约20%,降低了工业合成的难度。最后优化获得的eIscB-D/eωRNA编辑效率相比原始IscB/ωRNA平均可提升20.2倍。


接下来研究者通过在RuvC结构域关键催化位点引入丙氨酸突变,通过筛选,开发了IscB切口酶 (eIscB H339A ,并与腺苷脱氨酶 (TadA-8e) 和胞嘧啶脱氨酶 (hA3A*) 分别融合开发出超高活性的迷你单碱基编辑器eiABE和eiCBE,最高位编辑效率分别可达到73.6%和79.2%。
此外,先前并没有研究证明IscB在小鼠体内可以产生高效编辑。研究者首先在小鼠N2a细胞系中针对PCSK9以及Tyr基因进行靶点筛选。测序结果表明eIscB-D在PCSK9-sg29这一靶点可实现58%的编辑效率,在Tyr-sg21靶点的编辑效率为47.1%。研究者随后通过胚胎注射eIscB-D/eωRNA系统靶向Tyr基因的1号外显子,破坏白化基因的表达,成功制备小鼠白化疾病模型。在F0代,75% (9/12只) 突变小鼠实现高效编辑 (平均编辑效率为58.8%) ,其中有5只产生编辑效率接近100%的完全白化表型。该研究首次证明了eIscB-D不仅可以在鼠源细胞系中产生高效编辑,并且可以通过胚胎注射高效制备疾病动物模型。
总的来说, 该研究成功开发了基于IscB的高活性迷你基因编辑工具,率先实现了小鼠体内高效编辑。 该研究极大增加了单个AAV载体安全高效递送碱基编辑或者先导编辑系统的可能性,丰富了基因编辑工具的应用场景,为将来用于体内基因治疗提供了高效的候选技术。
华东师范大学博士研究生薛念念,硕士研究生洪迪珊,博士后张丹以及硕士研究生王茜为本文的共同第一作者,华东师范大学为第一单位,华东师范大学李大力研究员,朱一凡、王立人副研究员为本文的共同通讯作者。华东师范大学生命科学学院刘明耀教授,宋高洁研究员、关玉婷研究员、新加坡国立大学胡纯一教授等对本项研究提供了重要支持。
原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.007


制版人:十一


参考文献

1. Wong, C. (2023). UK first to approve CRISPR treatment for diseases: what you need to know. Nature 623, 676–677.

2. Pausch, P., Al-Shayeb, B., Bisom-Rapp, E., Tsuchida, C.A., Li, Z., Cress, B.F., Knott, G.J., Jacobsen, S.E., Banfield, J.F., and Doudna, J.A. (2020). CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369, 333-337.

3. Harrington, L.B., Burstein, D., Chen, J.S., Paez-Espino, D., Ma, E., Witte, I.P., Cofsky, J.C., Kyrpides, N.C., Banfield, J.F., and Doudna, J.A. (2018). Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science 362, 839-842.

4. Chen, W., Ma, J., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H., Fu, W., Pan, D., Shi, J., and Ji, Q. (2023). Cas12n nucleases, early evolutionary intermediates of type V CRISPR, comprise a distinct family of miniature genome editors. Mol. Cell 83, 2768-2780.e2766.

5. Karvelis, T., Druteika, G., Bigelyte, G., Budre, K., Zedaveinyte, R., Silanskas, A., Kazlauskas, D., Venclovas, Č., and Siksnys, V. (2021). Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature 599, 692-696.

6. Xiang, G., Li, Y., Sun, J., Huo, Y., Cao, S., Cao, Y., Guo, Y., Yang, L., Cai, Y., Zhang, Y.E., et al. (2023). Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors. Nat. Biotechnol. 42, 745-757.

7. Saito, M., Xu, P., Faure, G., Maguire, S., Kannan, S., Altae-Tran, H., Vo, S., Desimone, A., Macrae, R.K., and Zhang, F. (2023). Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease. Nature 620, 660-668.

8. Jiang, K., Lim, J., Sgrizzi, S., Trinh, M., Kayabolen, A., Yutin, N., Bao, W., Kato, K., Koonin, E.V., Gootenberg, J.S., et al. (2023). Programmable RNA-guided DNA endonucleases are widespread in eukaryotes and their viruses. Sci. Adv . 9, eadk0171.

9. Altae-Tran, H., Kannan, S., Demircioglu, F.E., Oshiro, R., Nety, S.P., McKay, L.J., Dlakić, M., Inskeep, W.P., Makarova, K.S., Macrae, R.K., et al. (2021). The widespread IS200/605 transposon family encodes perse programmable RNA-guided endonucleases. Science 374, 57-65.

10. Xu, X., Chemparathy, A., Zeng, L., Kempton, H.R., Shang, S., Nakamura, M., and Qi, L.S. (2021). Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol. Cell 81, 4333-4345.e4334.

11. McGaw, C., Garrity, A.J., Munoz, G.Z., Haswell, J.R., Sengupta, S., Keston-Smith, E., Hunnewell, P., Ornstein, A., Bose, M., Wessells, Q., et al. (2022). Engineered Cas12i2 is a versatile high-efficiency platform for therapeutic genome editing. Nat. Commun . 13, 2833.

(可上下滑动阅览)

THE END