CCR | GD2 CAR-T治疗髓母细胞瘤最新进展
髓母细胞瘤（Medulloblastoma，MB）是儿童期最常见的恶性胚胎性脑肿瘤，约占所有小儿中枢神经系统恶性肿瘤的20%。世界卫生组织(WHO)将MB列为4级肿瘤，起源于位于后颅骨沟的神经元前体。目前标准治疗包括手术、放疗和化疗，但通常会导致认知、神经和内分泌系统的副作用。
近日，意大利耶酥儿童医院（IRCCS，Bambino Gesù）肿瘤血液学及细胞和基因治疗科系的 佛朗哥·洛卡特利团队 在 Clinic Cancer Research 发表题为 GD2-targeting CAR T-cell therapy for patients with GD2+ medulloblastoma 的文章， 展示了针对二唾液酸神经节苷脂（GD2）的嵌合抗原受体 (CAR T) 细胞疗法的研究，旨在发现一种潜在更有效并减少长期治疗副作用的治疗方法。
GD2在神经母细胞瘤、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、许多尤文肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、小细胞肺癌和神经胶质瘤细胞中高表达，但在正常组织中的表达很有限。而且据报道，GD2 在小细胞肺癌和乳腺癌中，参与肿瘤发展，介导增加细胞增殖、生长、运动、迁移、粘附和侵袭。此外它通过与抑制性免疫受体Siglec-7相互作用，介导免疫抑制活性。该团队评估了CAR.GD2 T细胞在治疗复发/难治性儿童神经母细胞瘤中的安全性和有效性（临床实验编号NCT03373097）。
这篇论文收集52名患者和健康人的组织和血液样本，通过细胞荧光分析进行GD2表达的评估。与CAR-GD2.CD28.4-1BBz同框的第三代iC9自杀基因（作为安全开关）的逆转录病毒载体用于转导T细胞。外周血单核细胞 (PBMC) 是从健康捐赠者获得的血沉棕黄层中分离的，T细胞由OKT3和抗 CD28单克隆抗体激活，第三天由带有CAR-GD2的逆转录病毒载体转导。通过MB 患者肿瘤活检和外周血 (PB) 检测分析GD2的细胞表面表达。通过细胞共培养和流式细胞仪检测来评估CAR-GD2 T细胞的抗肿瘤效果。
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原代 MB 活检和 MB 细胞模型中的 GD2 表达
为研究MB是否可以作为CAR.GD2 T细胞的合适靶点，研究人员对临床接受治疗的 52 名 MB 患者进行活检，以评估肿瘤活标本上GD2的表达。尽管有异质性，但82.68% 的分析样本在流式细胞术分析中都表现出GD2 阳性，在CD45 阴性细胞中平均值为 50.46+/-35.90% GD2阳性细胞。另外在活检组织中GD2 表达的中值荧光强度 (MFI)高于外周血样。
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CAR.GD2 T细胞在人源GD2+ MB 细胞系中显示有效的抗肿瘤活性
在体外长期共培养实验中，无靶T细胞（NT）和源自五个健康捐赠者CAR.GD2 T细胞与D283 Med、DAOY 或 MED 411-FHTC 细胞以1:1（E:T）的比例混合，与NT T细胞相比
CAR.GD2 T细胞能够明显地杀死D283 Med和MED 411- FHTC 细胞 （图1，A and C）; 相比之下，当CAR.GD2 T 细胞与表征GD2 抗原的百分比和 MFI 较低的DAOY 细胞共培养时，只观察到了次优的抗肿瘤反应（图1，B）。细胞因子的产生量与CAR.GD2 T 细胞表现出的抗 MB 活性有密切的关系 （图1，D，E，F）
图1- CAR.GD2 T 细胞在人源 GD2+ MB 细胞系和 MB-PDX 细胞的体外抗肿瘤活性
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EZH2 抑制剂在GD2低表达MB 细胞系体外实验中能增加 GD2的表达
鉴于MB 细胞系上 GD2 表达的异质性, 研究人员研究了他泽美司他对GD2低表达的MB 肿瘤是否也能产生相同的效果。在DAOY (SHH) 和 MED-411 FHTC 细胞系培养中加入他泽美司他（1 或 10 mmol/L）或同等体积的DMSO 为阴性控制，7 天后，他泽美司他明显地增加了GD2 在这两株MB 细胞系中的表达 （图2，A-C）。在5 天共培养实验中，CAR.GD2 T 细胞使DAOY细胞减少表明，高、低浓度的他泽美司他在DAOY细胞系中能诱导GD2 靶抗原上调（图2，C）。
图2-用他泽美司他抑制 EZH2 可上调 DAOY（SHH 亚组）MB 细胞中的 GD2 表达
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CAR.GD2 T细胞在异种MB小鼠中显示抗肿瘤活性
在MB NSG 小鼠模型中，使用原位植入 D283 Med细胞，肿瘤移植三天后，小鼠随机分为NT T 细胞组或 CAR.GD2 T 细胞组，静脉注射治疗的CAR.GD2 T 细胞来自两个健康捐赠者（图3，A和B）。正如预期的那样， NT T细胞组的小鼠，在不到一个月的时间内，肿瘤生物发光迅速增强到三个数量级，而接受 CAR 治疗的小鼠组，在第 30 天后肿瘤明显地得到控制（图3，B-D），无病生存率明显高于NT T细胞小鼠组（图 3，E）。CAR.GD2 T细胞治疗的小鼠出现人源异种移植反应迹象，八分之三的小鼠在缓解期死亡（图 3F），可能是由于移植物抗宿主病（GVHD），在加大T细胞注入量的小鼠身上副作用更明显（图3，G和H），更重要的是， 45 天后循环 CAR+ T 细胞的百分比仍然可检测到，并且随着时间的推移而有所增加（图 3H）。
图3- CAR.GD2 T 细胞的抗肿瘤活性在人源D283 Med-GFP-FF-Luc 细胞系原位小鼠模型中的评估
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将 DAOY MB 细胞系植入 30 只 NSG 小鼠颅内，其中一半通过口服强饲法喂入他泽美司他，研究人员评估了他泽美司他有穿过血脑屏障（BBB）的能力，并使肿瘤细胞对 CAR GD2 T细胞敏感。小鼠使用他泽美司他并接受 CAR.GD2 T 细胞显示出明显的早期抗肿瘤反应（T 细胞输注后第 6 天），然而，在 CAR.GD2 T 细胞治疗第14天，研究人员没有观察到两组之间的肿瘤控制的差别。这一发现与体外实验结果高度一致，表明GD2 MFI 水平的降低和停止使用他泽美司他有关。
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静脉注射CAR.GD2 T细胞浸润到MB组织可增加MB PDX模型中小鼠的总生存率
为了进一步研究 CAR.GD2 T 细胞在体内的功能，NGS小鼠被植入 Med-411FH mCherry / Luciferase 细胞，肿瘤形成后第 15天，小鼠接受静脉注射输注NT T细胞或 CAR.GD2 T 细胞。在NTT小鼠组中，40天后，肿瘤的生物发光迅速增加到3个数量级，而接受CAR GD2 T 细胞的小鼠，肿瘤生长时间有较长的控制，并且生物发光信号有显着降低，一句话，总生存率增加。此外，与对照小鼠相比，CAR.GD2 T 细胞在外周血循环的T 细胞中 (CD45+/CD3+) 数量有显着的增加。
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AP1903 能激活 iC9 自杀基因，在MB-PDX 小鼠模型中可消除CAR.GD2 T 细胞
为了消除CAR GD2 T 细胞的毒性，研究人员评估了可否通过全身给药AP1903来激活 iC9 自杀基因达到快速消除血液循环中和渗透到大脑/MB 中的 CAR T 细胞。免疫组织化学分析表明CAR.GD2 T 细胞能穿过血脑屏障（BBB）渗透到肿瘤中，而且通过AP1903 治疗的小鼠，渗透到大脑/MB中的T细胞消失了，证明AP1903有穿过血脑屏障并消除肿瘤浸润 CAR.GD2 T 细胞的能力，如图4所示。A-建模设计图，Med-411 FH mCherry/Luc PDX 细胞被立体定向植入 13 只 NSG 小鼠的小脑中。肿瘤移植30 天后，12 只小鼠通过静脉注输入T 细胞（其中 6 只小鼠为 CAR.GD2 T 细胞，6 只小鼠为 NT T 细胞）。第 10 天，给小鼠AP1903药，六分之三接受 NT T 细胞治疗的小鼠和六分之三接受 CAR.GD2 T 细胞治疗的小鼠接受了连续三剂 AP1903（100 毫克/天/小鼠）。给药前一天和实验结束时第 14 天，对实验小鼠的外周血进行人源 T 细胞的流式细胞术分析。B-AP1903 有效诱导循环 CAR.GD2 T 细胞的明显减少。C- 对MB 的小鼠进行人源 CD3+ T 细胞（左）或 CAR+ T （右）流式细胞术分析，未经处理的 GD2 T 细胞（上）和经 AP1903 处理的细胞（下）。
图4-AP1903 激活 iC9，并导致 MB 异种移植小鼠模型外周血中的 CAR.GD2 T 细胞迅速减少
这篇论文首次报告了GD2在大量MB儿科患者中表达的评估，发现尽管异质性大，但GD2在诊断时在大多数 MB 病例中过度表达。更重要的是，SHH 和 G3/G4 亚组显示出最高的 GD2 表达，因此 CAR.GD2T 细胞疗法对这类最具攻击性的MB亚型患者是一种合适的免疫疗法。
最近的 I/II 期临床试验显示了CAR.GD2 T 细胞在神经母细胞瘤患者中治疗的安全性和疗效。鉴于这些前提，GD2是可被选择作为肿瘤相关的MB 患者的抗原，被 CAR.GD2 T 细胞靶向。在对 GD2+ MB 的临床前实验中，该论文报告了 CAR.GD2 T 细胞介导通过长期共培养实验证明，对 GD2+ MB 细胞系和 MB PDX 模型具有显着的杀伤活性 。实验还证明了肿瘤识别和消除与抗原表达水平密切相关。癌细胞上靶抗原的低表达是众所周知的CAR T细胞疗法耐药的潜在机制。最近，有报道除骨肉瘤细胞外，尤文肉瘤、神经母细胞瘤和肺癌，使用他泽美司他EZH2 抑制剂，可选择性地和可逆性地诱导 GD2 表面表达而不改变细胞其他性质。研究人员还证明了他泽美司他可以穿过血脑屏障并上调MB细胞中GD2的表达，使它们对 CAR.GD2 T 细胞的杀伤力敏感。此外，自杀基因 iC9 能够增加CAR.GD2 T 细胞疗法的安全性，通过使用AP1903激活iC9自杀基因诱导快速消除血液循环和已经穿过血脑屏障的CAR T 细胞。希望这些结果在 GD2+ MB 患者中进行 的I/II 期临床试验（NCT05298995）得到验证。
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Purpose: Medulloblastoma (MB), the most common childhood malignant brain tumor, has a poor prognosis in about 30% of patients. The current standard of care, which includes surgery, radiation, and chemotherapy, is often responsible for cognitive, neurologic, and endocrine side effects. We investigated whether chimeric antigen receptor (CAR) T cells directed toward the disialoganglioside GD2 can represent a potentially more effective treatment with reduced long-term side effects.
Experimental design: GD2 expression was evaluated on primary tumor biopsies of MB children by flow cytometry. GD2 expression in MB cells was also evaluated in response to an EZH2 inhibitor (tazemetostat). In in vitro and in vivo models, GD2+ MB cells were targeted by a CAR-GD2.CD28.4-1BBζ (CAR.GD2)-T construct, including the suicide gene inducible caspase-9.
Results: GD2 was expressed in 82.68% of MB tumors. The SHH and G3-G4 subtypes expressed the highest levels of GD2, whereas the WNT subtype expressed the lowest. In in vitro coculture assays, CAR.GD2 T cells were able to kill GD2+ MB cells. Pretreatment with tazemetostat upregulated GD2 expression, sensitizing GD2dimMB cells to CAR.GD2 T cells cytotoxic activity. In orthotopic mouse models of MB, intravenously injected CAR.GD2 T cells significantly controlled tumor growth, prolonging the overall survival of treated mice. Moreover, the dimerizing drug AP1903 was able to cross the murine blood-brain barrier and to eliminate both blood-circulating and tumor-infiltrating CAR.GD2 T cells.
Conclusions: Our experimental data indicate the potential efficacy of CAR.GD2 T-cell therapy. A phase I/II clinical trial is ongoing in our center (NCT05298995) to evaluate the safety and therapeutic efficacy of CAR.GD2 therapy in high-risk MB patients.
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-23-1880
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