【论著】| CDC20通过稳定NLRP3的表达促进食管癌细胞增殖的研究

基金项目：国家自然科学基金（81972330）。

第一作者：关瑞瑞，硕士。

通信作者：韩涛，博士，教授；周祥，博士，研究员。

食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）是临床常见的消化系统恶性肿瘤，发病率高、预后差、生存率低 ^［1］。据统计，中国每年因ESCA死亡的人数约为15万人 ^［2］。相比其他国家，中国ESCA的发病率偏高。ESCA主要分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC） ^［3］，中国主要以ESCC为主。ESCC早期诊断困难，疗效不佳，尽管手术切除和辅助放化疗等治疗方法有所改进，但5年生存率仍仅为15%~20% ^［4］。通过对ESCA的发生、发展机制进行研究，寻找新的诊断和治疗靶向标志物，从而延长患者生存期及改善患者预后是目前亟待解决的问题。

后期促进复合物/细胞周期体（anaphase promoting complex/cyclosome，APC/C）是一种多亚基E3泛素连接酶，被认为是调节细胞周期和肿瘤发生、发展的主要驱动力 ^［5-6］。APC/C与共刺激蛋白CDC20结合，形成具有活性的APC ^CDC20复合物，通过泛素化修饰降解底物，包括细胞周期相关和肿瘤相关癌蛋白等，调控细胞周期进展并影响肿瘤的发生、发展。CDC20被认为具有促进肿瘤发生的作用。有研究 ^［7］显示， CDC20是一种必需的发育基因，在小鼠中敲除 CDC20基因会引起有丝分裂停滞，导致胚胎死亡。在小鼠皮肤肿瘤模型中条件性敲除内源CDC20能够阻止肿瘤形成 ^［8］。近年来，有研究 ^［9-10］显示，CDC20在各种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的发展有关。CDC20在促进和维持肿瘤细胞增殖中发挥重要作用，CDC20在胶质母细胞瘤中表达上调，在低级别胶质瘤中表达下调 ^［11］。此外，CDC20的过表达与胶质母细胞瘤的发展高度相关，表明CDC20可作为标志物用于在活检中鉴定胶质母细胞瘤 ^［12］。CDC20通过降解p21 CIPI/WAF1维持胶质瘤细胞增殖和存活，并且CDC20抑制能够诱导胶质瘤细胞的细胞周期停滞 ^［13］。Jiang等 ^［14］研究显示，与正常乳腺上皮细胞相比，CDC20在乳腺癌细胞中呈高表达。与人乳腺癌患者样本中的癌旁组织相比，乳腺癌组织中的CDC20表达更高 ^［14］。CDC20通过多种途径调节乳腺癌细胞的生长，如重组蛋白通过抑制CDC20降低乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭 ^［15］。支架/基质附着区结合蛋白1（scaffold/matrix attachment region-binding protein 1，SMAR1）在维持基因组稳定性和细胞周期进程中发挥关键作用，CDC20通过促进SMAR1的蛋白酶体降解从而促进肿瘤细胞增殖 ^［16］。CDC20还可以通过调节上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）进展，沉默 CDC20可增加E-钙黏蛋白的表达水平，降低N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平和Ki-67增殖指数，并抑制HCC细胞迁移和侵袭 ^［17］。CDC20的高表达与上皮性卵巢肿瘤的不良预后密切相关，表明CDC20是卵巢癌预后的生物标志物 ^［18］。Kim等 ^［19］研究报道，CDC20在超过70%的胃癌组织中呈高表达，暗示CDC20是胃癌的潜在生物标志物。综上，CDC20在大多数癌症中呈高表达，提示其具有致癌作用，而CDC20在ESCA中的作用及其分子机制等仍不明确。

炎症小体失调与肿瘤的发生、发展也密切相关。炎症小体是细胞内多蛋白质信号转导复合物，其作为对内源性危险信号的炎性免疫应答在细胞溶质区室中形成。炎症小体的形成能够激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1 （caspase-1），引发焦亡，随后裂解促炎细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-1β前体以产生活性形式 ^［20］。炎症小体复合物由Nod样受体（NOD-like receptor，NLR）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CRAD，ASC）和caspase-1组成。NLRP3是极具特征性的炎症小体之一，属于NLR蛋白家族，是一种三元蛋白质，包含一个氨基末端嘧啶结构域（pyrin domain，PYD）、一个中央NACHT结构域和一个羧基末端富含亮氨酸的重复结构域（leucine-rich repeat，LRR） ^［21］。NLRP3表达的失调与肿瘤发展、自身免疫性疾病和神经退行性疾病密切相关 ^［22］。近年来，关于NLRP3在肿瘤中的研究日益增多，有研究 ^［23］显示，肿瘤组织中NLRP3蛋白水平高于非癌组织，且肿瘤标本中的NLRP3高表达与TNM分期和T分期显著相关。NLRP3表达升高通过参与调控细胞周期蛋白D1表达及诱导IL-1β产生来增强胃癌中的细胞分化，同时激活的IL-1β与其受体结合并激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），导致细胞增殖、侵袭和癌症发展 ^［24］。此外头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）与慢性炎症密切相关，NLRP3在HNSCC组织中表达升高，其表达程度与预后相关。HNSCC可通过NLRP3途径诱导活性IL-1β的产生，从而促进肿瘤细胞侵袭和增殖 ^［25］。近年来，有研究 ^［26-27］表明，慢性炎症与肺肿瘤进展密切相关。天冬氨酸诱导间皮细胞中的NLRP3活化最终导致肺癌的发生、进展。动物实验显示，肺和脾中NLRP3 mRNA表达水平较高 ^［28］，肺泡巨噬细胞中NLRP3 mRNA表达最高 ^［29］。NLRP3在ESCC中的作用罕见报道 ^［30］。2020年Yu等 ^［31］研究报道，激活NLRP3能够促进ESCA细胞增殖和迁移。上述结果提示NLRP3在ESCA中可能发挥癌基因作用。而在ESCC中，CDC20是否通过影响NLRP3表达促进ESCC细胞增殖尚不清楚，本研究旨在探究CDC20和NLRP3在ESCC中的作用及其机制，以期为ESCC的综合治疗提供新思路。

1.2.1  资料来源和数据分析

在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer. gov/）中下载TCGA-ESCA的RNA FPKM数据和患者临床资料，并纳入了GTEx公共数据库（https://www.gtexportal.org/home/datasets）中ESCA的正常组织信息，分析CDC20和NLRP3在ESCA组织与正常组织中的表达差异及临床意义。所纳入的数据集需符合以下标准：① 组织样本均来自ESCA组织或正常组织；② 至少包含10个样本差异分析和预后分析。

1.2.2  临床标本来源

收集新乡医学院第一附属医院收治的80例ESCC患者的癌组织和癌旁组织标本。本研究通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会的审批（编号：EC-021-137）。纳入标准：① 术后病理学检查确诊病理学类型为ESCC：② 组织切片结构完整，无脱片。排除标准：① 临床及病历资料有遗漏；② 患者术前进行过放化疗。

1.3.1  质粒构建、细胞培养和转染

质粒构建：NLRP3、ASC和pro-Caspase-1质粒均由武汉大学病毒学国家重点实验室吴建国教授提供。关于Flag-PYRIN、Flag-NACHT和Flag-LRR质粒构建，根据标准分子克隆方法，将PYRIN、NACHT和LRR结构域的相应片段克隆到pcDNA3.1-Flag载体上。PYRIN正向引物序列为5’-GCATGGATCCAAGATGGCAA GCACCCGC-3’，反向引物序列为5’-GCATCTCG AGCTATAAACCCATCCACTCCTCTTC-3’；NACHT正向引物序列为5’-GCATGGATCCCTGG AGTACCTTTCGAGA-3’，反向引物序列为5’-GC ATCTCGAGCTAGATCTTGCAACTTAAT-3’；LRR正向引物序列为5’-GCATGGATCCTCTCAGC AAATCAGGCTG-3’，反向引物序列为5’-GCATC TCGAGCTACCAAGAAGGCTCAAAGAC-3’。

细胞培养和转染：采用含10%胎牛血清、青-链霉素的DMEM或RPMI-1640高糖培养基，将细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁生长融合度达80%时，加入胰蛋白酶消化并传代。对于敲低CDC20和NLRP3的慢病毒包装，采用PEI转染HEK-293T细胞的方法。第1天HEK-293T细胞生长融合度为80%~90%，取出1.5 mL Eppendorf试管做好标记，每个Eppendorf试管中加入700 μL无血清培养液、1 µL PMD2和2 µL pspax2；每个Eppendorf试管加入2.5 µL shCDC20或shNLRP3质粒，混匀。再加入转染试剂16.5 µL。静置15 min，将此混合液滴加到HEK-293T细胞培养皿中。

1.3.2  慢病毒感染

慢病毒培养液准备：在前1天HEK-293T细胞转染之后，第2天更换8 mL DMEM培养基；第3天收集病毒培养液放到50 mL离心管4 ℃存放，再更换8 mL DMEM培养基；第4天收集病毒培养液与前1天病毒培养液混合，用0.45 nm过滤器过滤，即制得慢病毒培养液。如不使用需-80 ℃存放，避免反复冻融，所得慢病毒培养液可分成若干离心管存放，5 mL/管。慢病毒感染和筛选：取对数生长期的EC9706和KYSE-150细胞，消化后接种于10 cm培养皿中培养过夜。第2天观察细胞生长融合度为20%~30%时可以准备慢病毒感染。从-80 ℃冰箱中取出提前准备好的慢病毒培养液，在自来水中融化，感染时用5 mL病毒培养液与5 mL RPMI-1640培养基混合，再加入20 µL聚凝胺（与总培养液1∶500），充分混匀，分早晚2次感染，2次间隔时间约12 h；第3天更换8 mL RPMI-1640培养液；第4天对感染细胞传代分皿，分成2批细胞，加入8 µL嘌呤霉素（与总培养液1∶1  000）筛选2或4 d感染成功细胞，筛选2或4 d后分别收集蛋白，采用蛋白质印迹法（Western blot）进行检测。

1.3.3  RTFQ-PCR检测

采用TRIzol试剂提取总RNA 。使用P rimeS cript反转录试剂盒通过反转录获得cDNA。RTFQ-PCR由ABI 7900HT RTFQ-PCR系统进行。 CDC20基因正义引物序列为5’-CGGAAGACCTGCCGTTACATTC-3’，反义引物序列为5’-CAGAGCTTGCA CTCCACAGGTA-3’； NLRP3基因正义引物序列为5’-AAGGGCCATGGACTATTTCC-3’，反义引物序列为5’-GACTCCACCCGATGACAGT-3’； GAPDH基因正义引物序列为5’-TGCACC ACCAACTGCTTAGC-3’，反义引物序列为5’-GGCATGG ACTGTGGTCATGA-3’。

1.3.4  Western blot检测

收集细胞，提取总蛋白，用Super-Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取40 µg蛋白进行8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，将分离的蛋白电泳转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，1×含吐温-20磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline with Tween-20，PBST）洗膜3次，每次10 min，加入稀释的CDC20、NLRP3和vinculin一抗，4 ℃摇床温育过夜。1×PBST洗膜4次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，室温摇床温育30 min，1×PBST洗膜4次，每次10 min，用电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）试剂显色。

1.3.5  CCK-8实验

用对照短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）（shscr）或shCDC20、shNLRP3慢病毒构建体感染的EC9706和KYSE150细胞，在补充有10%FBS的RPMI-1640培养基中，通过CCK-8实验进行细胞增殖测定。所有操作按照试剂盒说明书进行，测定450 nm处的吸光度（ D）值。

1.3.6  免疫组织化学检测

所选取的ESCC石蜡标本在切片之后用免疫组织化学SP法进行染色，染色及切片扫描实验由武汉塞维尔生物科技有限公司进行。结果由2名经验丰富的病理科医师进行双盲阅片。NLRP3阳性表达为细胞质上呈现棕黄色颗粒，CDC20阳性表达为细胞质和细胞核上呈现棕黄色颗粒，以细胞质为主，每例镜下随机采集10个细胞视野，以镜下阳性细胞百分比和染色强度给予评分。染色肿瘤细胞的阳性百分比定义为：0，无染色；1，＜20%；2，20%~75%；3，＞75%。染色肿瘤细胞的强度评分标准为：0，阴性；1，弱（淡黄色）；2，中度（棕黄色）；3，强染色（棕褐色）。染色指数=阳性百分比×强度评分。

1.3.7  免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）实验

在HEK-293T细胞中，同时转染HA-CDC20 、Flag-NLRP3、Flag-ASC1、Flag-Caspase1和EV（对照组）质粒，验证CDC20与NLRP3、ASC1和Caspase1之间的相互作用。具体为：第1天在10 cm细胞培养皿中，HEK-293T细胞密度为70%~80%，同时转染HA-CDC20、Flag-NLRP3、Flag-ASC1、Flag-caspase-1和EV（对照组）质粒，第2天早上更换6 mL DMEM培养基，晚上加6 μL MG132，第3天收集蛋白样品，1 mg总细胞裂解物与8 µL琼脂糖单克隆抗HA抗体4 ℃摇床温育4 h。免疫复合物用NETN缓冲液（20 mmol/L Tris，pH=8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%NP-40）洗涤4次，采用Western blot检测结果。

在HEK-293T细胞中，同时转染HA-CDC20、Flag-NLRP3、Flag-Pyrin、Flag-NACHT、Flag-LRR和EV（对照组）质粒，验证CDC20与NLRP3中的哪一个区域相互作用。具体为：第1天在10 cm细胞培养皿中，HEK-293T细胞密度为70%~80%，同时转染HA-CDC20、 Flag-NLRP3、Flag-Pyrin、Flag-NACHT、Flag-LRR和EV（对照组）质粒，第2天早上更换6 mL DMEM培养基，晚上加6 μL MG132，第3天收集蛋白样品，1 mg总细胞裂解物与8 µL琼脂糖单克隆抗Flag抗体（＞0.6 μg/μL）4 ℃摇床温育4 h。免疫复合物用NETN缓冲液（20 mmol/L Tris，pH=8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%NP-40）洗涤4次，采用Western blot检测结果。

1.3.8  泛素化实验

蛋白酶体抑制剂实验（即MG132实验）：用对照shRNA（shscr）或shCDC20慢病毒构建体感染的EC9706和KYSE150细胞，分为2组，1组为对照组，另1组则加入MG-132（与培养液1∶1  000）继续培养，12~18 h后统一收集蛋白样品，进行Western blot检测。泛素化实验：用对照shRNA（shscr）或shCDC20慢病毒构建体感染的EC9706细胞，加入MG132（与培养液1∶1  000）继续培养12~18 h后统一收集蛋白样品，分为WCL组和NLRP3-IP组，NLRP3-IP组的细胞裂解物与NLRP3抗体4 ℃摇床温育4 h，再加入Protein A/G 4 ℃摇床温育1~2 h，免疫复合物用NETN缓冲液（20 mmol/L Tris，pH=8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%NP-40）洗涤4次，采用Western blot检测结果。

图1   CDC20、NLRP3在ESCA组织中表达上调

Fig. 1 The expression of CDC20 and NLRP3 was up-regulated in ESCA tissues

TCGA database results showed that CDC20 (A) and NLRP3 (B) were highly expressed in ESCA tissues. ****: P＜0.000 1, compared with adjacent

tissue.

图2   免疫组织化学法检测ESCC组织及癌旁组织中NLRP3、CDC20蛋白表达及二者相关性分析

Fig. 2 Immunohistochemical detection of NLRP3 and CDC20 protein expression in ESCC tissues and adjacent tissues, as well as correlation analysis between NLRP3 and CDC20 protein

A, B: CDC20 (A) and NLRP3 (B) is highly expressed in ESCC tissues (SP staining, ×40). C, D: Comparison of CDC20 (C) and NLRP3 (D) scores between ESCC tissues and adjacent tissues generated in (A, B). E, F: The protein expression levels of CDC20 (E) and NLRP3 (F) in ESCC with different degrees of differentiation (Ⅰ-Ⅳ phase). G: Positive correlation between CDC20 and NLRP3 expression in ESCC tissues. ***: P＜0.001, compared with cancer tissues.

图3   分析CDC20、NLRP3与免疫浸润细胞的相关性

Fig. 3 Analysis of the correlation between CDC20, NLRP3 and immune infiltrating cells

A, B: The TIMER system assessed the correlation between CDC20 (A), NLRP3 (B) and the level of infiltration of different immune cells (CD8 ⁺T cells, CD4 ⁺T cells, macrophages, B cells, dendritic cells and neutrophils) in ESCA. C, D: Effect of CAN on the level of immune cell infiltration in ESCA based on CDC20 (C) and NLRP3 (D) characteristics. E: Relationship between CDC20 and NLRP3 in TME. *: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001.

图4   CDC20正调节NLRP3表达

Fig. 4 CDC20 protein positively regulates NLRP3 expression

A: Co-IP showed that CDC20 proteins bind to NLRP3 proteins. B: Schematic diagram of domain structure for CDC20 and NLRP3. C: Co-IP shows that the binding region of CDC20 and NLRP3 is located in the LRR region. D, E: WB showed that knockdown of CDC20 in EC9706 (D) and KYSE150 (E) cells resulted in decreased levels of NLPR3 protein expression. F, G: Image J analysis of NLRP3 protein generated in (D, E). H, I: qRT-PCR analysis the mRNA level of EC9706 (H), KYSE150 (E) cells generated in (D, E). J, L: WB results showed that knockdown of CDC20 and treatment with MG132 in EC9706 (J) and KYSE150 (L) cells resulted in elevated levels of NLRP3 protein compared to shscr. K-M: Image J analysis of NLRP3 protein generated in (J, L). N: WB results showed that knockdown of CDC20 decreased the ubiquitination level of NLRP3 in EC9706. **: P＜0.01; ****: P＜0.000 1.

图5   在ESCA细胞系中敲低CDC20和NLRP3后细胞增殖能力减弱

Fig. 5 Cell proliferation weas reduced after knockdown of CDC20 and NLRP3 in ESCA cell lines

A, B: Cell proliferation analysis showed significant reduction in cell proliferation after CDC20 knockdown in EC9706 (A) and KYSE150 (B). C, D: Western blot analysis of EC9706 (C) and KYSE150 (D) cells infected with control (shscr) or the indicated shCDC20 lentiviral shRNA constructs. E, F: Cell proliferation analysis showed significant reduction in cell proliferation after NLRP3 knockdown in EC9706 (E), KYSE150 (F). G, H: WB analysis of EC9706 (G) and KYSE150 (H) cells infected with control (shscr) or the indicated shNLRP3 lentiviral shRNA constructs. *: P＜0.05; **: P＜0.01; ****: P＜0.000 1.

ESCA是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，总治愈率＜10%。在临床上，超过50%的病例表现为全身性疾病，难以治愈。在具有局部病变的患者中，大多数患者在初次治疗后会复发，治愈率为12%~35% ^［32］。目前，手术、化疗和放疗是ESCC的主要治疗选择，然而生存率低且易复发，导致患者生存质量下降，寻找新的靶向标志物和开发新的治疗策略迫在眉睫 ^［33］。本研究结果显示，CDC20和NLRP3在ESCA中高表达，敲低 CDC20和 NLRP3能够抑制ESCA细胞增殖，进一步研究发现，CDC20通过泛素化NLRP3稳定其表达促进ESCA细胞增殖，这些结果与 CDC20在肿瘤中发挥癌基因作用的报道一致。

NLRP3是炎症小体的主要组成部分，炎症及持续感染可能会导致各种恶性肿瘤，炎症能够影响癌症的血管生成和侵袭。然而，炎症小体是否参与免疫系统在肿瘤中的作用仍不清楚 ^{［34- 35］}。肿瘤的发生、发展涉及多个复杂的生物学过程，TME在ESCC的发生、发展中发挥重要作用。在肿瘤发生的早期，TME中的免疫细胞等可以形成有抑瘤作用的炎性环境。肿瘤浸润性T淋巴细胞是抗肿瘤免疫反应中最重要的效应细胞，也是决定恶性肿瘤患者预后的重要因素 ^［36-37］。在TME浸润的淋巴细胞中CD8 ⁺T细胞约占60%，是杀伤肿瘤细胞最主要的武器，其浸润丰度与患者预后密切相关。我们的前期研究 ^［36］也发现，CD8 ⁺T细胞高浸润ESCC患者的总生存期更长，暗示CD8 ⁺T细胞可能成为评估ESCC患者预后的一个潜在的免疫指标。且经COX回归分析检测，发现仅用CD8 ⁺T细胞浸润丰度为指标尚不足以预测ESCC患者的预后，提示可能存在其他影响因素。本研究发现NLRP3和CDC20与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关联。 本研究结果显示，CDC20表达与肿瘤纯度呈显著正相关关系，NLRP3表达与B细胞、CD8 ⁺ T细胞、CD4 ⁺ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞的免疫细胞浸润水平呈显著正相关关系。 进一步研究还发现CDC20显著影响ESCA中CD4 ⁺ T细胞、中性粒细胞及树突状细胞的浸润水平，NLRP3显著影响ESCA中CD8 ⁺ T细胞、中性粒细胞及树突状细胞的浸润水平。 上述结果表明，CDC20和NLRP3对ESCA患者的TME具有关键调节作用，且CDC20与NLRP3之间可能存在相互协调的作用。 这些结果与我们的前期研究 ^［36］ 的结果一致，提示ESCC的发生、发展及患者预后与多个免疫指标相关。

CDC20是细胞周期的重要调节因子，且肿瘤发生与细胞周期失调密切相关。本研究结果也证实了CDC20与NLRP3的直接相互作用，且敲低 CDC20能够降低NLRP3的表达。此外，泛素化实验证实了CDC20通过泛素-蛋白酶体途径调节NLRP3的稳定性。但CDC20如何泛素化以及通过哪些泛素化位点发挥作用，仍待进一步研究。此外，关于细胞周期失调是否会引起炎症反应及参与免疫调节仍未知，也值得进一步探讨。

总之，本研究揭示了在ESCC中CDC20通过稳定NLRP3促进ESCC细胞增殖，且发现CDC20与NLRP3以及多种免疫细胞，如CD8 ⁺T细胞与CD4 ⁺T细胞之间存在相关性，因此CDC20和NLRP3可能是潜在的ESCA诊断靶向标志物。本研究结果也提示，将CDC20或NLRP3与免疫治疗联合应用等对延长患者生存期和改善预后、提高生活质量可能具有一定意义。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

关瑞瑞：完成实验，撰写文章；

郝茜，张雅琦：参与实验；

孙庆港，陈怡恬：生信分析，参与实验；

李秀敏：参与文章修改；

周祥，韩涛：实验设计和监督，指导文章修改。