Nat Cancer | 中性粒细胞与肿瘤细胞物理相互作用促进乳腺癌侵袭性

撰文： huacishu

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亮点：

细胞间通讯形成复杂的信号网络，维持组织稳态；然而， TME 中的异常相互作用可以通过上调侵袭性肿瘤细胞特性和激活其他组织驻留细胞（包括巨噬细胞（肿瘤相关巨噬细胞）和成纤维细胞（ CAFs ））来促进癌变。本文通过在乳腺癌 TME 中研究分泌和物理相互作用，发现了中性粒细胞衍生的信号作为肿瘤侵袭性的重要诱导因素。

以色列特拉维夫大学 Merav Cohen 教授课题组在国际知名期刊 Nat Cancer 在线发表题为 “ Neutrophils physically interact with tumor cells to form a signaling niche promoting breast cancer aggressiveness ” 的论文。

乳腺的组织重塑和细胞可塑性是由多谱系通讯激活的；然而，促进癌症的动态信号仍然不清楚。通过对乳腺发育和癌变过程中单个细胞和物理相互作用细胞（ PIC ）的 RNA 测序，作者发现中性粒细胞在早期发育过程中短暂出现，并在晚期癌症中与肿瘤细胞的物理相互作用中重新出现。中性粒细胞异质性分析表征了与年龄和癌症分期相关的转录状态。

将配体 - 受体和 PIC 测序分析与各种功能实验相结合，揭示了一个物理和分泌的致瘤信号生态位。这种方法揭示了中性粒细胞被肿瘤激活的巨噬细胞招募，并与肿瘤细胞发生物理相互作用，增加了肿瘤细胞的增殖和侵袭特性，以及内皮细胞增殖和血管生成。中性粒细胞 -PIC 中上调的分子程序与晚期癌症患者的低生存率相关。这种相互作用驱动的观点突出了癌症治疗的潜在分子靶点和生物标志物。

1 、乳腺组织的多谱系细胞状态

首先在发育阶段和青春期从癌基因载体（ PyMT ⁺ ）和非载体对照（ PyMT ^- ）组织中纯化单细胞，探索了诱导乳腺生理发育的过程。然后，继续研究了代表 PyMT ^- 对照组年轻（ 6 周和 8 周）和成年（ 10 周和 12 周）组织维持的时间点（图 1a ）。作者的目标是分离和分子表征多种免疫细胞和非免疫细胞，以彻底探索推动乳腺癌症发展和进展的细胞异质性、生态位组成和细胞间通讯。

图 1. 生理发育和癌变过程中乳腺免疫和非免疫谱系的全面特征

对来自 PyMT ⁺ 和 PyMT ^- 乳腺的 16778 个 CD45 ⁺ 免疫细胞和 12783 个 CD45 ^- 非免疫细胞进行了单细胞分选、测序和分析。为了进一步了解上皮异质性，增加了 8645 个 CD45 ^- EpCAM ⁺ 上皮细胞（图 1b ）。这些免疫、非免疫和上皮细胞被合并在一起，通过基于标志基因表达的聚类和注释，确定了各种免疫和非免疫细胞类型和状态（图 1b 、 c ）。

2 、独特的细胞生态位与发育和癌症有关

在 PyMT ⁺ 和 PyMT ^- 小鼠的早期发育过程中，中性粒细胞的丰度更高（图 2a ）。同样，施旺细胞在早期发育中表现出更高丰度的模式。然后，比较不同条件下的细胞组成（ PyMT ⁺ 与 PyMT ^- 小鼠），突出了致癌过程中特有的细胞动力学。作者发现导管巨噬细胞从第 6 周开始扩大（图 2b ），随着肿瘤的进展进一步增加。在基质部分，作者看到 CAF 、内皮 Mcam ^hi 细胞和周细胞也有类似的富集趋势（图 2c ， d ）。虽然 Myo/Lum 细胞的比例随着时间的推移而下降，但肿瘤细胞的比例却增加了（图 2e ）。

这些结果突出表明，乳腺的生理学和乳腺癌症的发展过程是高度动态的，伴随着发育和病理条件下不同细胞生态位的形成。

图 2. 乳腺细胞组成的动态分析揭示了肿瘤特异性细胞生态位

作者进行了分层聚类，确定了三个具有相似丰度动态的细胞生态位，将其定义为发育、稳态和肿瘤生态位（图 2f ）。在发育生态位中，作者观察到许多细胞状态在 10 天和 3 周的样本中最为丰富，包括 PyMT ⁺ 和 PyMT ^- 小鼠（图 2f ）。从 6 周开始，发现了一个仅在成熟的 PyMT 乳腺中建立的细胞生态位，其特征是出现特定的细胞状态（图 2f ）。

作者发现了一种特异性出现在成年 PyMT ⁺ 小鼠乳腺中的肿瘤生态位。该生态位的特征是免疫和非免疫细胞的积累（图 2f ）。通过免疫荧光染色，验证了上皮（ EpCAM ⁺ ）和免疫（ CD45 ⁺ ）细胞，特别是巨噬细胞（ CD45 ⁺ F4/80 ⁺ ）在小鼠 PyMT ⁺ 乳腺导管周围（图 2g ）和人类浸润性导管癌肿瘤微环境中的积聚和空间接近性（ IDC ；图 2h ）。通过定义乳腺中不同生物过程中涉及的细胞生态位，将实验和分析重点放在肿瘤特异性细胞生态位上。

3 、中性粒细胞与乳腺肿瘤细胞发生物理相互作用

根据所述注释（图 1b ），作者分析了所有免疫和上皮 / 肿瘤细胞，以及另外 8158 个 CD45 ⁺ EpCAM ⁺ 免疫上皮 - 肿瘤细胞 PICs ，这些物理相互作用细胞是在发育过程中、青年 / 早期癌和成年 / 晚期癌时间点（图 3a 、 b ）。在上皮室中，发现 PICs 中细胞状态的出现与其在正常和肿瘤组织中的单细胞丰度直接相关。在免疫亚群中，发现了 PICs 中细胞富集的几种模式，这些模式沿着阶段分布，并横跨健康和肿瘤组织（图 3c ）。例如，在发育过程中， mregDCs 在 CD45 ⁺ EpCAM ⁺ PIC 中富集（图 3c ， d ），而导管巨噬细胞在单独状态和 PIC 的肿瘤样本中都是占主导地位的群体（图 3c 、 e ）。

图 3. PIC-seq 分析显示，在 TME 中，中性粒细胞在与上皮细胞的物理相互作用中富集

值得注意的是，作者发现了 PICs 中性粒细胞富集的独特模式。在晚期癌症期间，中性粒细胞与上皮细胞的物理串扰显著增加（图 3c ， f ）。通过量化 CD45 ⁺ 单独状态和 CD45 ⁺ EpCAM ⁺ PIC 中 Ly6G ⁺ 中性粒细胞的 FACS 染色（图 3g ）、通过共聚焦显微镜观察 CD45 ⁺ Ly6G ⁺ EpCAM ⁺ 分选双细胞（图 3h ）以及通过代表性 12 周 PyMT ⁺ 组织的 ImageStream 分析来验证这一结果。从转录上讲，作者认为这些 PIC 表现出中性粒细胞和上皮细胞的联合基因表达谱（图 3i ）。

此外， 12 周时 PyMT ⁺ 乳腺的 IF 染色显示， CD45 ⁺ Ly6G ⁺ 中性粒细胞和 EpCAM ⁺ 上皮细胞在 TME 中物理接触（图 3j ）。总之，晚期乳腺癌期间中性粒细胞重新出现，可以通过关注 TME 中与肿瘤细胞物理接触的免疫细胞来确定这一现象。

4 、乳腺 TME 中性粒细胞异质性

为了鉴定和分离数据中的中性粒细胞单独状态，将 CD45 ⁺ Ly6G ⁺ 和 CD45 ⁺ 单独状态合并，并选择中性粒细胞标志物基因（ Csf3r 、 Retnlg 和 S100a8 ）高表达的细胞。然后，对 1759 个中性粒细胞进行了聚类，并根据标志和功能基因程序的表达确定了七个主要组（图 4a ）。作者确定了两种在 PyMT ⁺ 和 PyMT ^- 乳腺早期发育过程中富集的中性粒细胞状态，被注释为高 cystatin 中性粒细胞态和一种年轻中性粒细胞态，它们也共享高 cystatin 标记基因（图 4a 、 b ）。

接下来，我们注释了与 II 类主要组织相容性复合体（ MHC ）途径相关的中性粒细胞状态表达基因，以及也过表达 Nr4a1 、 Nfkbid 和 Tnfaip3 等基因程序的表达 Ptgs2 的中性粒细胞状态（图 4a ）。在 PyMT ⁺ 小鼠中， MHC-II 和 Ptgs2 ⁺ 单独状态中性粒细胞均出现在早期癌症中，并在后期时间点下降（图 4b ）。其余三种状态主要在晚期癌症期间富集，因此被注释为肿瘤相关中性粒细胞（ TAN ；图 4b ）。

图 4. 乳腺发育和肿瘤进展过程中中性粒细胞的异质性状态

肿瘤进展过程中的中性粒细胞状态动态（图 4b ）促使我们通过 FACS 定量和蛋白质染色进行验证（图 4c ， d ）。在早期癌症（ 8 周 PyMT ⁺ ）中，表达 MHC-II 和 PTGS2 的 CD45 ⁺ Ly6G ⁺ 嗜中性粒细胞的百分比较高，而在晚期癌症（ 12 周 PyMT ^- ）中， TAN （ LCN2 ^high 细胞）更为丰富（图 4c ）。在 PyMT ⁺ 乳腺的晚期癌 TME 中也发现了不同的神经营养状态（图 4d ）。

接下来，研究了小鼠乳腺中 TAN 的基因特征是否与癌症患者的存活率相关。为此，选择了高表达和高分化的基因，将丰富的 TAN 状态（ TAN1 和 TAN2 ）与其他中性粒细胞状态分离，并将其转化为同源的人类基因。处于 III 和 IV 期且 TAN 基因得分高表达的癌症患者表现出显著较低的生存模式（图 4e ）。因此，作者发现乳腺 TAN 基因评分可以作为预测晚期乳腺癌症患者生存率的生物标志物。

为了更好地了解中性粒细胞转录组谱是否是乳腺特有的，作者从患有晚期癌症的 PyMT ⁺ 小鼠的外周血中分离并测序了 2397 个中性粒细胞（图 4f ）。在组织特异性中性粒细胞基因特征中，发现了与 Ptgs2 ⁺ 中性粒细胞状态相关的基因和 TME 中具有功能特性的基因（图 4f ）。然后，进一步比较了血液中性粒细胞和不同乳腺中性粒细胞状态中选定基因的表达（图 4g ）。值得注意的是，血液中性粒细胞主要与年轻的 TAN 亚群（ Ngp 、 Camp 和 Ltf ）共享其基因特征，这表明年轻的 TANs 可能是 TME 中新招募的细胞（图 4g ）。

进一步结果发 TME 中性粒细胞与血液中的中性粒细胞相比共享特定的转录程序（例如 Ptgs2 、 Cxcl2 、 Ccr2 和 Il1b ）（图 4h ）。总体而言，这些发现表征了乳腺 TME 中中性粒细胞转录的异质性，并进一步表明不同原发肿瘤部位的 TAN 之间存在 TME 相关的转录组特征。

5 、中性粒细胞驱动肿瘤生态位中的细胞间信号传导

值得注意的是，许多相互作用与细胞粘附（图 5a ）和中性粒细胞募集（图 5b ， c ）有关，突显了肿瘤生态位的潜在作用。在 12 周 PyMT ⁺ 小鼠的乳腺外植体培养物孵育 24 小时后，收集了含有乳腺 TME 分泌因子的条件培养基（图 5d ）。

用 CM 预激活或在常规培养基中孵育的骨髓来源巨噬细胞用作骨髓来源中性粒细胞的化学引诱剂，将其接种在 Transwell 膜上（图 5d ）。与正常培养基巨噬细胞相比，条件培养基巨噬细胞显著增强了中性粒细胞的募集（图 5e ）。在建立的离体模型中阻断了 CCL3 信号传导（图 5d ），并发现迁移的中性粒细胞数量减少（图 5f ）。这表明乳腺 TME 激活的巨噬细胞通过 CCL3 信号招募中性粒细胞。

图 5. TAN- 肿瘤细胞 PICs 与乳腺 TME 中的导管巨噬细胞和血管周围隔室形成信号生态位

然后，作者量化了嗜中性肿瘤细胞 PIC 与肿瘤生态位中其他细胞状态之间的相互作用数量（图 5g ）。由于中性粒细胞 - 肿瘤细胞 PICs 与血管周围群体（内皮 Mcam ^hi 和周细胞）的相互作用数量最多，进一步研究了这种相互作用中的显著相互作用，并鉴定了编码促血管生成配体的基因（ Vegfa 和 Osm18 ；图 5h ， i ）。这验证了 Ly6G ⁺ EpCAM ⁺ /S100A9 ⁺ EpCAM ⁺ 中性粒细胞 - 肿瘤细胞 PICs 与 12 周 PyMT ⁺ 乳腺 TME 和浸润性导管癌患者 TME 中 CD31 ⁺ 内皮细胞的空间接近性（图 5j ， k ）。

综上所述，肿瘤生态位内存在复杂的分泌和物理串扰，中性粒细胞被肿瘤激活的巨噬细胞招募，与肿瘤细胞发生物理相互作用，并诱导促血管生成信号。

6 、中性粒细胞 - 肿瘤细胞 PICs 表达原癌基因程序

由于在晚期癌症期间，所有五种中性粒细胞状态（ MHC-II neut 、 Ptgs2 ⁺ neut 、 Young TAN 、 TAN1 和 TAN2 ）都与 PyMT ⁺ 乳腺中的肿瘤细胞发生物理相互作用，作者将 PIC-seq 基因分析分为这些状态，并分析了每种中性粒细胞状态是否在其相应的 PIC 中诱导了不同的基因程序。值得注意的是， Ptgs2 ⁺ Neut 、 TAN1 和 TAN2-PICs 显示出与转移、迁移和侵袭相关的基因上调，如 Rsad2 、 Rock2 和 Nup88 （图 6a ）。

图 6 中性粒细胞与癌症细胞的物理相互作用具有高度恶性分子特征

作者还发现， MHC-II Neut 、 Ptsg2 ⁺ Neut 和 TAN2 与肿瘤细胞的物理相互作用与 Lalba 基因表达的显著下调有关（图 6c ）。值得注意的是，这与增殖相关基因的上调有关，如 Btf3 （在 MHC-II 和 Ptgs2 ⁺ Neut PICs 中）和 Cdk9 （年轻 TAN 和 TAN1 PICs ；图 6c ）。此外，发现肿瘤细胞主要与 Ptgs2 ⁺ Neut 和 TAN1 亚群的物理相互作用上调了 TME 中与血管生成相关的基因（ Vegfa 、 Osm 和 Ero1a ；图 6d ）。与两个单独状态群体相比， Ki67 ⁺ 增殖群体在中性粒细胞 - 肿瘤细胞 PIC 中显著富集（图 6e ）。

在鉴定了小鼠乳腺 TME 中 PICs 的促肿瘤基因特征后，作者检查了其与癌症患者临床数据的关系。通过计算在 PIC 中显著上调和在 PIC 中过表达的基因来定义中性粒细胞 - 肿瘤细胞 PIC 基因评分（ NeuTME-PIC ）。这种相互作用相关基因评分与晚期癌症患者的生存率差显著相关（ III 和 IV ），但与早期无关（ I 和 II ）（图 6h ）。

总之， TME 中中性粒细胞与肿瘤细胞的物理相互作用与促进侵袭、增殖和血管生成的分子程序的上调有关，这与人类晚期癌症患者的生存率下降有关。该特征可以作为晚期癌症患者生存率预测和疾病分期分层的生物标志物。

7 、中性粒细胞支持癌症增殖和血管生成

为了进一步探讨中性粒细胞单独状态和 PIC 在 TME 中的功能作用，作者验证了 Ki67 和 VEGFA 的表达与中性粒细胞和肿瘤细胞之间的物理相互作用有关。具体而言，与所有条件下的单独状态肿瘤细胞相比，增殖的肿瘤细胞在共培养衍生的 PIC 中富集（图 7b ）。此外，与所有条件下的单独状态肿瘤细胞和中性粒细胞相比，共培养 PICs 的 VEGFA MFI 都更高（图 7c ）。这些结果表明，增殖和血管生成过程与中性粒细胞 - 肿瘤细胞的物理串扰有关。

图 7 乳腺 TME 中性粒细胞的肿瘤前作用取决于它们的物理相互作用

接下来，作者试图在体内评估神经营养素对 TME 中诱导的致瘤特征的功能作用。发现中性粒细胞耗竭导致 TME 中 Ki67 ⁺ 增殖的 EpCAM ⁺ 肿瘤细胞（图 7f ）、 CD45 ⁺ EpCAM ⁺ 免疫肿瘤 PICs （图 7g ）和 CD31 ⁺ 内皮细胞（图 7h ）的百分比降低。这一结果表明，神经营养因子促进乳腺 TME 中的肿瘤和内皮细胞增殖。

此外，对来自治疗小鼠的 EpCAM ⁺ 肿瘤细胞和 CD31 ⁺ 内皮细胞进行了分类和测序。 DGE 分析显示与癌症侵袭性和细胞周期相关的基因显著下调（图 7i ）。在中性粒细胞耗竭小鼠的上皮细胞中，与 G1 到 S 相转变作为细胞周期进程的一部分的正调控相关的基因，如 Ddx3x ，显著降低。中性粒细胞耗竭小鼠的内皮细胞显示出与 VEGFA 驱动的血管生成、肿瘤生长和转移相关的基因表达显著降低（图 7j ）。

通过 PIC-seq 分析的结果以及蛋白质水平和功能验证，揭示了巨噬细胞辅助中性粒细胞募集的生态位信号网络，随后是中性粒细胞、肿瘤细胞和血管系统之间的相互串扰。 PIC 血管系统串扰促进内皮细胞增殖和 VEGFA 诱导的血管生成，而 PIC 肿瘤细胞信号传导诱导肿瘤细胞增殖和侵袭特性增加（图 7k ）。

8 、结论

作者通过在乳腺组织发育和癌症阶段应用单细胞 RNA 测序（ scRNA-seq ）和 PIC 测序（ PIC-seq ），发现中性粒细胞在发育过程中短暂扩张，在晚期癌症过程中中性粒细胞与癌症细胞的物理相互作用中富集。通过整合 PIC-seq 、配体 - 受体分析和功能测定，发现了一个由中性粒细胞 - 肿瘤细胞 PIC 、导管巨噬细胞和脉管系统之间的相互串扰激活的信号生态位。此外，中性粒细胞和肿瘤细胞的物理相互作用上调了促癌分子特征，这也与晚期癌症患者的低存活率显著相关。因此，作者的相互作用驱动方法进一步阐明了中性粒细胞在乳腺癌症进展中的关键功能作用。

教授介绍

Merav Cohen 教授就职于以色列特拉维夫大学。实验室专注于利用最先进的单细胞 RNA 测序技术，探索免疫细胞与组织驻留细胞之间的细胞通讯。渴望揭示免疫控制的细胞相互作用对组织生理发育以及组织特异性病理（特别是癌症）的影响。实验室结合实验小鼠模型、先进的基因组技术和计算分析，以及对临床样本的研究，以拓展我们对发育性病理、癌症诱导机制、肿瘤微环境和转移部位的免疫抑制以及癌症进展的理解。

参考文献

Camargo S, Moskowitz O, Giladi A, et al. Neutrophils physically interact with tumor cells to form a signaling niche promoting breast cancer aggressiveness. Nat Cancer. Published online March 7, 2025. doi:10.1038/s43018-025-00924-3