张泽民院士团队再次拿下Cell顶刊！大规模样本测序揭示非小细胞肺癌新辅助免疫治疗后的免疫微环境异质性

前不久小编刚给大家分享过张泽民院士团队发表在 Cancer Cell 上的研究论文（ 张泽民院士团队又一 Cancer Cell 力作：三阴性乳腺癌化疗和 PD-L1 阻断联合治疗的免疫景观 ），没想到仅一个多月后张泽民院士又联合多个合作团队（多达 10 个通讯 ！ ）发表了题为 “ A single-cell atlas reveals immune heterogeneity in anti-PD-1-treated non-small cell lung cancer ” 的重磅研究论文，这次直接 Cell 顶刊拿下！小编第一时间进行了学习，迫不及待地来给大家分享一下。

摘要图

背景介绍

非小细胞肺癌（ NSCLC ）是全球癌症相关死亡的主要原因，主要包括肺鳞状细胞癌（ LUSC ）和肺腺癌（ LUAD ）等亚型。对于早期和可切除的 NSCLC ，通常进行根治性手术，但是手术中通常无法识别微小转移，因而导致 30% – 55% 的患者会出现疾病复发。新辅助（术前）免疫治疗与化疗相结合可以通过消除这些微小转移来改善手术结果。 III 期 CheckMate 816 和 KEYNOTE-671 试验报告称，接受新辅助抗 PD-1 治疗和化疗的患者中，约 20% 实现了肿瘤完全消退，为患者带来了极大的希望。然而，非小细胞肺癌的新辅助免疫治疗仍存在两大未被满足的临床需求：（ 1 ）约 40% 的患者响应性较低，且耐药机制尚不明确。（ 2 ）约 20% 的患者在上述治疗后复发，且目前缺乏精准识别高复发风险患者的生物学标记物。这是因为个体对新辅助免疫治疗的敏感性的差异，然而我们对此仍不充分理解。因此，识别 non-MPR 患者的耐药机制，并开发预测患者复发风险的生物学标志物对非小细胞肺癌的临床实践具有重要的指导价值。

主要结果

1. 抗 PD-1 治疗的 NSCLC 肿瘤浸润免疫细胞大规模图谱

研究者首先从 3 34 名组织学确诊为 LUSC 或 LUAD 且接受抗 PD-1 联合化疗的患者中筛选出 2 34 名病理反应率大于 9 0% 的患者（ MPR ），发现治疗持续时间和不同的抗 PD-1 药物与 MPR 无显著关联，突出了 TIME 异质性及其在反应程度变化中的重要性。随后对这些患者的手术切除肿瘤进行了 scRNA/TCR-seq 分析。经过质控和注释后，得到了涵盖肿瘤浸润 T 细胞、自然杀伤（ NK ）细胞、 B 细胞和髓细胞的 51 个免疫细胞亚型的大型免疫图谱。

图 1 . 抗 PD-1 治疗非小细胞肺癌中肿瘤浸润免疫细胞的大规模图谱

2. 免疫细胞亚群丰度的分析揭示了五种 TIME 亚型

基于免疫细胞亚型组成的变异性反映 TIME 异质性的基本认识，研究者计算了每位患者（检测到免疫细胞数量多于 500 的 2 22 名患者）总 CD45+ 细胞中每种免疫细胞亚型的比例，并应用非负矩阵分解得到了五种不同的 TIME 亚型（ TIME-NK ， TIME-BE ， TIME-Teff ， TIME-Treg 和 TIME-Mye ）。结果显示，每位患者被分配到单个 TIME 亚型，并表现出特定免疫细胞亚型的富集，其 MPR 率（最大百分比响应率）各不相同，说明五个 TIME 亚型与治疗反应相关。

图 2 . 免疫细胞亚群丰度分析揭示五种 TIME 亚型

3. FGFBP2+ NK/NK 样 T 细胞在 TIME-NK 患者中富集

接下来，研究者逐步深入挖掘了五个 TIME 亚型的特征。

首先，在 TIME-N K 亚型中，大多数患者都达到了 MPR ，并存在三种 NK/NK-like T 细胞亚型，包括 NK_CD16low_GZMK 、 NK_CD16hi_FGFBP2 和 CD8T_NK-like_FGFBP2 。它们由 FCGR3A （编码 CD16 ）的差异表达或 CD8+ T 细胞标记而区分，并且不表达 PDCD1 从而可能不会被抗 PD-1 剂直接激活，但是它们都具有高细胞毒性潜力，表明 FGFBP2+ NK/NK 样 T 细胞可能促进 TIME-NK 患者肿瘤消退。

图 3. FGFBP2+ NK/NK 样 CD8+ T 细胞在 MPR 患者中富集

4. B 细胞聚集形成在 TIME-BE 患者中富集

接下来，在 TIME-BE 亚型中，患者表现出高 MPR 率和记忆 B 细胞的显著浸润， CD20 免疫染色分析证实了该发现。此外，已知三级淋巴结构（ TLSs ）与临床预后改善相关，其关键组分是滤泡辅助性 T 细胞（ Tfh 细胞）和树突状细胞。结果还发现 TIME-BE 患者 Tfh 和树突状细胞浸润水平较高，表明 B 细胞聚集可能代表 TLSs 。随后研究者遵循一个已建立的 multiplexed immunofluorescence (mIF) 方案来评估 TIME-BE 亚型中 B 细胞聚集体代表的是成熟的还是未成熟的 TLSs 。具有 DC-LAM 信号的 TLSs 为成熟的 TLSs ，具有 CD21 DC-LAMP 信号的 B 细胞聚集体为未成熟的 TLSs 。在具有 B 细胞聚集体的患者中， MPR 患者与未 MPR 患者相比，成熟的 TLSs 数量增加，表明成熟的 TLSs 在促进免疫疗法反应中发挥作用。

图 4 . TIME-BE 患者 TLS 形成

5. 不同 T 细胞亚群在 TIME-Teff 和 TIME-Treg 患者中富集

接下来，在 TIME-Teff 和 TIME-Treg 两种亚型中， CD45+ 细胞中总 T 细胞水平相当，但 MPR 率和 T 细胞亚型丰度方面存在显著差异，包括 CD8+ T 细胞和 CD4+ T 细胞的 T 细胞亚型均存在差异。研究者进一步比较了两种 TIME 亚型患者中的 Treg 亚型异质性。首先确定了三种 Treg 亚型，包括增殖性 Treg 、 CCR8− Treg 和 CCR8+ Treg ，发现两种 TIME 亚型患者在这些 Treg 亚型的组成比例中存在差异性。

6. TIME-Teff 和 TIME-Treg 的患者的 T 细胞扩张模式存在差异

接下来，作者进一步利用 scTCR-seq 数据分析了 TIME-Teff 和 TIME-Treg 两种 TIME 亚型中肿瘤浸润 T 细胞的克隆扩增特征。首先关注 CD8+ T 细胞，基于“ 与扩增的终末 Tex 细胞共享 TCR 的 CD8+ T 细胞，无论其转录特征如何，都具有相同的抗原特异性 ”的认识，研究者关注了与扩增的终末 Tex 细胞共享 TCR 的 CD8+ T 细胞，并将其称为 Tex 相关细胞，这类细胞里有一类未标注为扩增的终末 Tex 细胞的 CD8+ T 细胞被称为前体耗竭 T 细胞（ Texp 细胞）。结果显示， TIME-Teff 患者的 Texp 细胞数量增加，而 TIME-Treg 患者的末端 Tex 细胞比例更高，与 PD-(L)1 阻断治疗反应和 MPR 率差异相关。然后关注 CCR8+ Tregs 的扩增模式，发现 TIME-Treg 患者的 CCR8+ Treg 克隆型数量和扩增程度更高。总之，两种肿瘤浸润 T 细胞的克隆扩增特征揭示了 TIME-Teff 和 TIME-Treg 患者不同的 T 细胞扩增模式。

图 5 . TIME-Teff 和 TIME-Treg 患者中不同的 T 细胞亚型和扩增状态

7. 五种 TIME 亚型中的 T 细胞扩增状态

由于 T 细胞在免疫治疗中的关键作用，研究者进一步分析了 Tex 相关细胞和 CCR8+ Treg 在五个 TIME 亚型中 MPR 和非 MPR 患者亚群中的扩增状态。具体地，首先分析关键 T 细胞克隆型在不同 TIME 亚型中的分布情况，然后在同一 TIME 亚型内比较了 MPR 和非 MPR 患者的 T 细胞扩增状态。结果发现，（ 1 ） Tex 相关细胞和扩增的 CCR8+ Treg 与治疗结果的相关性在 TIME-Teff 和 TIME-Treg 亚型以外的其他亚型中也存在；（ 2 ）非 MPR 患者中 T 细胞扩增状态存在异质性。

图 6 . 五种 TIME 亚型中 T 细胞扩增状态

8. Texp 细胞在 Tex 相关细胞中的比例与无病生存期相关

由于非 MPR 患者更容易在在接受新辅助免疫治疗后出现疾病复发，因此研究者研究了相关的风险因素。

首先，在所有患者中，通过分析与无病生存期（ RFS ）相关的免疫特征，结果发现 TIME-NK 或 TIME-Teff 患者的复发风险最低，而 TIME-Treg 或 TIME-Mye 患者的 RFS 降低，因此进一步研究 T 细胞扩增特征与 RFS 的关系。结果发现， Texp 细胞在 Tex 相关细胞中的比例较高与无病生存期（ RFS ）增加最显著相关。

然后，在非 MPR 患者中，也发现了 Tex 相关细胞中 Texp 细胞比例较高与非 MPR 亚型的复发风险降低相关，并且在所有非 MPR 患者中， Tex 相关细胞中 Texp 细胞的平均比例（ 80.5% ）确定了一个复发风险显著降低的亚群，与 MPR 患者相当。此外， Tex 相关细胞中 Texp 细胞比例可以作为比病理反应率更好的预测复发风险的标志物。