动态演变：从癌前病变到侵袭性肺腺癌

今天给各位介绍这一篇近期发表在 Theranostics 上的文章，该团队利用单细胞测序技术联合空间转录组学，共同探究肺腺癌从癌前病变到侵袭性变化进展中的过程。究竟怎么样，我们一起看看吧！

标题： An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma

期刊： Theranostics （中科院 1 区 IF ： 12.4 ）

PMID: 38418883 DOI: 10.1038/s41586-024-07113-9

一、 研究背景

原位肺腺癌(AIS) 详细的细胞群和基因 变化 ，以及它与 肺腺癌 （ LUAD ） 从AIS 到 微浸润性腺癌 (MIA) 及浸润性腺癌 (IAC) 侵袭性进展相关的 细胞 空间信息仍然知之甚少 ，因此，迫切需要测序技术来确定细胞类型特异性动态变化 。

二、 实验结果

图1. 本研究的研究设计和主要发现。

1 、 LUAD 细胞类型鉴定及侵袭 进展过程中的差异表达基因 结果

该团队首先收集了 AIS 、 MIA 、 IAC 各 3 个样本进行 scRNA-seq 测序（图 1 A ），经过质控总共获得了 115,246 个细胞，大致分为 C1 到 C10 的 10 个细胞谱系，其中 6 种细胞类型由经典的基因定义，包括上皮细胞、 T/NK 细胞、 B 细胞、骨髓细胞、内皮细胞 、成纤维细胞（图 1 B-C ）。使用 IF 来校准细胞的基因标记物的表达 ( 图 1D) 。为进一步探讨 LUAD 侵袭过程的机制，研究人员比较了每种细胞类型的基因表达模式， MIA 和 AIS (M/A) 组之间有 512 个上调和 332 个下调的 DEG ， IAC 和 MIA (I/M) 组之间有 199 个上调和 347 个下调的 DEG ， IAC 和 AIS (I/A) 组之间有 393 个上调和 345 个下调 DEG 。 并且 ，I/A 组中 近 一半上调的DEG 在 M/A 组中已经可检测到（图 1 E-F ）。 DEG 的 PCA 显示 MIA 和 IAC 在转录组水平上非常接近（图 1G ）， 这 进一步揭示了LUAD 三个不同阶段的丰富细胞类型（图 1 H ）。

2、上皮细胞的亚群鉴定及LUAD的起源

为了确认启动 LUAD 侵袭的关键癌细胞亚簇， 该团队 将上皮细胞重新 分析 聚类为8 个亚群，包括肺泡 I 型、肺泡 II 型、 Clara 细胞 、纤毛细胞 等 4 个正常上皮亚群 和 Clara-like 、 TM4SF1+ 、 CRABP2+ 、 UBE2C+ 这 4 个癌细胞亚群。相对于另外两个癌细胞亚群， TM4SF1+ 和 UBE2C+ 癌细胞亚群比例在 LUAD 侵袭过程中不断增加，在 IAC 中急剧升高，并且从 AIS 到 MIA ， UBE2C + 亚型的比例变化比 TM4SF1+ 亚型更 为显著 （图2 C ）。 IF 和 bulk RNA-seq 的结果也证实 了 UBE2C + 亚型癌细胞从 AIS 逐渐稳定地增加到 IAC （图 2 D-E ）。 接着该团队 通过TCGA-LUAD 数据库 也 验证了UBE2C+ 癌细胞对 LUAD 患者预后的影响，发现它可以作为 LUAD 预后的生物标志物（图 2 F ）。 ssGSEA 分析发现， UBE2C+ 癌细胞主要富集 于 MYC 靶点 V1 、细胞周期、 AKT 和 TGF-β 信号通路等，这 类 细胞可能通过这些途径促进癌症的 发生发展 （图2 G ）。 并且 拟时序分析结果表明，UBE2C+ 癌细 胞是分化最差的癌细胞类型和终末细胞类型（图 2 H ） 。

图2. UBE2C+细胞亚群参与LUAD的整个侵袭过程。

3、UBE2C+细胞亚群参与LUAD 的整个侵袭过程

体外实验证 明 UBE2C 通过影响 LUAD 增殖和侵袭 性 来介导LUAD 的恶性 病理生理过程 （图3C-D ）。此外，体内实验表明 敲低 UBE2C 能 显着 抑制 皮下肿瘤的生长（图3E-G ）。这些结果表明 UBE2C 介导 LUAD 细胞的增殖和转移。

图3. 高表达UBE2C促进肺腺癌细胞的侵袭和转移。

4、LUAD侵袭中不同TME细胞亚群的研究

接着该团队开始探索不同 类型 TME细胞在LUAD侵袭过程中的变化，对主要细胞群进行了进一步研究。将T/NK细胞重新聚类为8个亚群、骨髓细胞重新聚类为10个亚群（图4 A）。结果发现，TPSB2 +肥大细胞和FCN1 +单核细胞占比从AIS和MIA到IAC逐渐持续下降，GNLY +NK细胞占比仅从AIS到MIA增加，而FOXP3 +Tregs的丰度从MIA到IAC显着升高（图4B）。通过bulk RNA-seq和IF进一步证实了细胞亚群变化的情况（图4 C-D）。接下来使用GSVA分析细胞亚群变化中涉及的潜在标志信号通路，细胞周期和细胞生长或增殖相关途径，如PI3K/AKT/MTOR信号等在GNLY+NK和Foxp3+NK中高度富集，WNT和干扰素信号等在TPSB2 +肥大细胞和FCN1+单核细胞富集（图4 E-F）。基于以上结果，该团队提出假设：Tregs 增加和单核细胞减少介导肿瘤相关通路的激活可促进早期LUAD侵袭。

图4 免疫细胞浸润在早期LUAD侵袭过程中的作用。

5、TGF-β信号通路在晚期LUAD的侵袭中发挥关键作用

CellChat 分析结果揭示 LUAD 中细胞之间的前十个相互作用途径（图 5 A ）。在 AIS 和 MIA 中没有观察到癌细胞和 TME 细胞之间通过 TGF-β 信号传导进行的通讯，但这种相互作用在 IAC 中显着加强，特别是在 NK 细胞 、肥大 细胞 和MALT B 细胞中（图 5 B) 。进一步的分析发现，与 AIS 和 MIA 相比，癌细胞和 TME 细胞中 TGF-β 配体的水平在 IAC 中广泛上调（图 5 C ）。同样的，下游靶基因以及 TGF-β 途径的下游因子 p-SMAD2 的表达水平在 IAC 中高度激活（图 5 D-E ）。这些结果意味着癌细胞和 TME 细胞 之间 TGF-β 信号传导的通讯和相互作用在 IAC 中诱导的 TGF-β 信号传导的无限制激活可能在晚期 LUAD 的侵袭中发挥关键作用。

图5 TGF-β信号通路在癌症细胞和TME间的对话作用图谱。

6. 癌症区域Tregs的空间分布介导LUAD侵袭

将 AIS 、 MIA 、 IAC 各 2 个样本进一步进行 空间转录组分析 。基于HE 染色，将样本分为四个不同的组织学区域，包括癌区域、正常上皮区域、基质区域和淋巴区域。 并 通过marker 基因的表达进一步证实了空间划分的准确性。如预期， TM4SF1+ 癌细胞、 GNLY+NK 细胞、 NKG7+NK 和 TPSB2+ 肥大细胞在癌症中共定位，但未发现 FOXP3+ Tregs （图 6 D ）。同样 地， 两例IAC 对应的空间和细胞数据也清晰 地 区分 为 四个区域。 其中 TM4SF1 + 癌细胞和 UBE2C+ 癌细胞在癌症区域富集， CAF （ Fib-1 ）和 FOXP3+Tregs 与癌细胞亚群共定位。与 AIS 相比， IAC 癌症脉管系统区域呈现出更明显的血管数量和更高表达水平的 VEGFs ，相反， AIS 没有明显的差异（图 6 E-G ）。这一发现表明血管生成可能对 LUAD 的侵袭过程有 促进作用 。

图6 TME空间分布对早期LUAD侵袭的影响。

7、ST分析癌边缘区域比癌中心区域更活跃

为了进一步了解 scRNA-seq 确定的四个癌症亚群的空间分布和生物学意义， 该团队 将癌症区域重新聚集为亚区。AIS 的 TD8 样本，由中央区 ( 黑色 ) 和外围区域 ( 红色 ) 组成。结果发现， Clar-like 癌细胞在外围区域高度富集，中央区域以 TM4SF1+ 癌细胞为主。 Wnt/β-Catenin 、血管生成通路等致癌信号在外围区域高度。值得注意的是，与 TGF-β 信号通路相关的基因在中心区域高表达 ( 图 7 E ）。最后，分析 IAC 样本 表明 ，中心区域和外围区域都高度富集TM4SF1+ 癌细胞和 UBE2C+ 癌细胞，特别是区域 5 ， TGF-β 信号通路相关的基因在癌区 5 高表达（图 7 C-E ）。总之，这些发现表明 UBE2C+ 癌细胞亚群在驱动 AIS 到 MIA 过程中起着至关重要的作用，癌细胞与 TME 之间的 TGF-β 信号相互作用以及调节免疫逃逸的空间变化 都 与LUAD 侵袭 性进展 有关（图7 G ）。

图 7 癌细胞的空间异质性。

三、 总结

该团队运用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 联合 空间转录组学(ST) 技术 ， 发现 肺腺癌（LUAD ）侵袭过程中的动态 变化 和连续 进展 过程中涉及的细胞和空间 状态 。研究发现，UBE2C+ 癌细胞亚群在 LUAD 侵袭过程中不断增加，其空间分布 主要集中 在浸润性腺癌（IAC ）的周边癌区域。此外，对 TME 细胞类型亚群的分析显示肥大细胞、单核细胞和淋巴内皮细胞不断减少，这些细胞参与了侵袭性 LUAD 的整个过程。同时，从 AIS 到 MIA 过程中 的NK 细胞和 MALT B 细胞增加，从 MIA 到 IAC 过程中 ，Treg 细胞和分 泌性 B 细胞有所增加。值得注意的是，对于 AIS ，癌细胞、 NK 细胞和肥大细胞共定位，对于 IAC ， Tregs 与癌细胞共定位。最后，癌细胞与 TME 细胞诱导的 TGF-β 信号通路的通讯和相互作用参与了 IAC 的侵袭。研究结果揭示了癌细胞和 TME 亚群的特定细胞信息和空间结构，以及它们之间的细胞相互作用，这将有助于 未来 在LUAD 从 AIS 到 IAC 的侵袭过程中 早期发现和靶向治疗 。 更多详情还请大家移步原文，仔细品鉴。