泛癌可变剪切30分思路分享

可变剪切的失调与许多人类疾病密切相关，了解转录物剪切的遗传变异对解析癌症的分子机制至关重要。 因此，可变剪切也是癌症研究的热点方向。生信人早在四五年前就开始推出可变剪切相关的分析思路及方法。小编今天再和大家分享一篇 23 年 11 月 发表在 GASTROENTEROLOGY(IF:29.4/Q1) 杂志上关于 可变剪切的文章。该文章全面分析了剪切 数量性状位点(sQTLs) 在癌症中的功能，并重点 分析了 其在结直肠癌(CRC) 中的独特作用 机制。 时隔几年可变剪切仍能发 30 分，可见可变剪切热度不减。长话短说，小编今天就带大家一睹为快。

Genetic control of alternative splicing and its distinct role in colorectal cancer mechanisms

可变 剪 切 的遗传控制及其在结直肠癌中的独特作用 机制

一．文章摘要

研究对 TCGA 泛癌样本进行了全面的 sQTL 分析，识别出 33 种癌症中控制信使 RNA 剪切的遗传变异，并对 154 例结直肠癌 (CRC) 样本进行了独立验证。 此外，研究也纳入了大规模、多中心、多种族的病例对照样本，对识别的关键 sQTIL 与CRC 风险的相关性 进行分析。最后研究也进行了一系列体外和体内生物学实验，分析并验证候选 sQTL 和靶基因的潜在机制。 最终研究揭示了 sQTL的分子特征及 其在肿瘤易感性中的独特作用。

二．文章的主要内容及结果

1.33种癌症剪切数量性状位点图谱的功能特征

研究首先在泛癌中分析了sQTL的功能特征。 研究 使用TCGA 数据， 识别了 33 种癌症的 9026 例肿瘤样本中的 168,694 个 可变剪切 ( AS) 事件和4,599,598 个sQTL( 图 1A) 。 研究观察到随着样本量的增加，剪切事件和 sQTL 的数量也 稳步增加( 图 1B) ，这意味着 新的剪切事件和 sQTL 仍有待发现。研究也观察到癌症特异性 的 sQTL -AS 对占总对 数 的51.86% ，这意味着它们在不同癌症中具有独特的调节作用 ( 图 1C) 。 研究通过位置富集分析也观察到 sQTL 在外显子区域显著富集( 图 1D) 。 研究也注释了 sQTL 在不同调控层面的分子特征，结果发现在启动子和增强子 等调控区域 sQTL 显著富集( 图 1E) 。在本分析中包含的所有 研究分析了 59 个转录因子 (TF) ， 观察到 NRF1 、 MYC 和 MNT 优先结合sQTL( 图 1F) 。 研究也观察到 sQTL 在 RNA 结合蛋白 (RBPs) 的结合位点富集( 图 1G) 。此外， 研究也发现 只有16.8% 的 sQTL 影响整体基因表达 ( 图 1I) ，表明基因表达和剪切事件的独立调控。此外，多种癌症中 表达数量性状位点 ( eQTL) 和sQTL 在 GWAS 信号中 都便显出 了过量的低P 值 ( 图 1I) 。 研究也发现 在检测的13 个性状中， sQTL 和 eQTL 分别解释了约0.37%-9.47% 和 1.01%-8.78% 的遗传力 ( 图 1J) 。

图 1 33 种人类癌症类型 sQTL 的识别和功能刻画

2.sQTL靶向基因增强了对生物学过程的解释

研究接着对sQTL的靶基因进行了分析刻画。 研究识别了 sQTL 的靶基因 ( sGenes ) ，并观察到其 在多种癌症相关通路( 图 2A) 和突变基因 ( 图 2B) 中富集。 sGenes 还 被发现具有大量的扩增和缺失负荷 ( 图 2C) 。 此外，研究也 观察到sGene 的表达与CD8+ T 细胞和调节性 T 细胞等免疫细胞的浸润密切相关 ( 图 2D) 。 研究也基于药物敏感性基因组学数据识别 了29,924 对 sGene-drug( 图 2E) 。

图2 sGenes的特征分析

3.中国结直肠癌患者剪切数量性状位点分析

研究接着对结肠癌的sQTL进行了重点分析。 研究收集了来自中国人群的154 个结直肠肿瘤和配对正常组织，并构建了首个sQTL 图谱( 图 3A) 。研究识别出11 个优先结合到含有sQTL 区域的RBPs ，其中包括几个剪切 因子( 图 3B) 。 研究也观察到肿瘤组织中多数 sQTLs 与 eQTLs 具有显著差异 ( 图 3C) ， 且 eQTLs 与影响同一基因的sQTLs 之间的距离较大 ( 图 3D) 。此外， 这两类 QTL 也 在CRC 的 GWAS 中 表现出 了过量的低P 值 ( 图 3E) 。 研究也发现了 32 个在肿瘤特异性sQTL 中富集 更强的 RBPs ( 图 3F) ，这些 sQTL 也 在CRC 中显著上调 ( 图 3G) 。 此外，研究还观察到与正常特异性 sQTL 相比，亚洲人群中 CRC 相关变异富含 CRC 特异性 sQTL( 图 3I) 。 研究也观察到 使用eQTL 或 sQTL PRS 的风险分层 更好 ( 图 3J) 。

图3 中国结直肠癌患者sQTL谱的验证

4.剪切数量性状位点变异rs61746794与多人群结直肠癌风险显著相关

研究接着分析了与CRC风险显著相关的sQTL。 文章首先将 sQTL( 图 4A) 与 CRC 风险的关联进行整合 ，结果发现了与结直肠癌风险最显著相关的位点 rs61746794( 表 1 和图 4B) 。研究接着将 rs61746794 在来自北京的 1524 例和 1522 例对照以及来自前列腺、肺癌、结直肠癌和卵巢癌筛查试验的 1233 例和 7398 例对照中进行进一步的 I 期复制，并发现 T 等位基因与 CRC 风险增加显著相关。在复制 II 阶段，研究也在来自武汉的 4500 例病例和 8500 例对照以及来自英国生物银行的 5246 例病例和 31476 例对照中验证了这种显著相关性。最后，研究将发现和复制阶段的结果结合起来，发现 rs61746794[TT] 基因型仍与亚洲和欧洲人群中 CRC 风险增加相关 ( 表 1) 。

表1 个体单核苷酸多态性与三期及联合样本结直肠癌风险的相关性分析

5.剪切数量性状位点变异rs61746794 T等位基因促进PRPF8介导的PRMT7外显子16剪切

研究接着对rs61746794 T等位基因相关外显子进行了分析。 研究 根据Ensembl 数据库 (GRCh37) 的注释和 TCGA SpliceSeq 的分析结果，观察到 人类PRMT7 基因模型共包含 20 个外显子，主要可以拼接成 28 个转录本。其中有 6 个转录本参与 AA_exon 16 剪切 事件，分别记为PRMT7-V1 至 PRMT7-V6( 图 4C) 。 研究接着发现 rs61746794 的 T 等位基因与 TCGA 和 该研究 数据中PRMT7 外显子 16 的替代受体位点密切相关 ( 图 4D 和 E) 。 研究也发现 当rs61746794-C 等位基因转变为 T 等位基因时， PRMT7 外显子 16 受体位点产生了更强的信号 ( 图 4F 和 G) 。

图4 rs61746794可能改变CRC中PRMT7外显子16剪切的功能性sQTL

接着研究试图分析 rs61746794 等位基因特异性活性的潜在机制。 根据 ENCORI 数据库 结果研究发现 PRPF8 特异性结合 PRMT7-V1 和 PRMT7-V2 中含有 rs61746794 的区域 ( 图 5A) 。此外， 研究 使用RBP 免疫沉淀和 RNA 拉下实验验证了 PRPF8 与 rs61746794-C 相比，主要结合在 rs61746794-T 区域 ( 图 5B 和 C) 。多个数据集 中也都观察到 与正常组织相比，PRPF8 在肿瘤组织中显著过表达 ( 图 5D) 。 研究也在 TCGA 和自己的数据中观察到， PRPF8 的表达与 CRC 中外显子 16.1 的包含水平呈负相关 ( 图 5E) 。此外， PRPF8 的表达水平与 PRMT7- v1 的表达呈负相关，而与 PRMT7- v2 的表达在群体 ( 图 5F) 和细胞系中呈正相关。 研究也观察到 PRPF8 的敲低 会 导致PRMT7 外显子 16 的 剪切 信号显著减弱( 图 5G 和 H) 。

图5 PRPF8优先结合rs61746794-T等位基因，促进致癌PRMT7剪切

6.PRMT7亚型通过催化H4R3和H3R2甲基化增加结直肠癌的风险

文章最后分析了PRMT7亚型增加CRC风险的机制。 研究发现 MT7 作为一个潜在的致癌基因 能够 促进CRC 的进展 ( 图 6A 和 B) ，与正常组织相比 PRMT7_AA_16.1 的 剪切百分比在肿瘤组织中也 显著下调( 图 6C) ，这表明外显子 16.1 的 剪切 可能与CRC 的发展有关。 因此，研究通过实验验证发现 与PRMT7- v1 或对照载体相比， PRMT7-V2 过表达 会 显著增强细胞增殖和集落形成能力( 图 6D 和 E) 。 研究也观察到 在体内过表达PRMT7-V2 的异种移植物的生长明显高于 PRMT7- v1 和对照 ( 图 6F) 。 此外， 与PRMT7- v1 过表达的细胞相比， 研究 在PRMT7- v2 过表达的细胞中 识别 了72 个显著差异的甲基化肽，代表 49 种独特的蛋白质， 其中包括 组蛋白H3(R9) 和 H4(R20) 肽的甲基化信号 ( 图 6G 和 H) 。 研究通过实验检测到 已知的PRMT7 底物，如 DDX23 和 CALM3 ， 并观察到 PRMT7-V2 过表达细胞中 H3R2me2s 和 H4R3me2s 的修饰均有所增加，但 H3 和 H4 未见明显变化 ( 图 6I) 。为了进一步确定 prmt7 依赖性组蛋白甲基化的转录调控作用， 研究 进行了RNA 测序，结果显示经典致癌信号通路中基因的转录发生了广泛的变化，包括 YAP 、 AKT 和 KRAS 通路 ( 图 6J 和 K) 。

图6 PRMT7亚型通过激活组蛋白精氨酸甲基化促进结直肠癌细胞增殖

到这里文章的主要内容就介绍完了。 文章首先全面分析了泛癌中剪切数量性状位点(sQTLs)的特征及功能，并通过生信及实验分析重点探索了其在结直肠癌(CRC)中的独特作用机制。 总之，该文章聚焦可变剪切，从泛癌入手逐渐聚焦关键癌型及关键事件，从公共数据分析筛选，对关键结果进行多种验证，逻辑清晰，内容丰富，十分值得小伙伴们参考。