前沿分享 | SPRINTER算法：解锁肿瘤克隆增殖的进化密码
癌症的增殖是其关键特征之一，然而，对于同一肿瘤内不同克隆间的增殖是否存在差异，此前并不明确。来自英国伦敦大学学院癌症研究所的Simone Zaccaria等研究人员，在 Nature Genetics发表了题为“Characterizing the evolutionary dynamics of cancer proliferation in single-cell clones with SPRINTER”的文章，介绍了一种名为SPRINTER的算法，该算法通过对单细胞全基因组DNA测序数据的分析，能够准确识别处于S期和G2期的细胞，并将其分配到不同的肿瘤克隆中，从而为估计克隆特异性增殖率提供了有效手段。
增殖在癌症发展中起着关键作用，且与多种肿瘤的不良预后相关。以往主要通过病理或实验技术测量肿瘤样本中S期细胞比例来估计增殖，但肿瘤存在异质性，不同克隆具有不同进化历史和作用，且此前缺乏联合测量克隆特异性增殖率和相关进化动力学的方法。单细胞全基因组DNA测序技术虽可对肿瘤克隆进行基因组和进化分析，但在识别S期细胞及克隆分配方面仍面临挑战。
研究对象：
主要为非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤样本，包括来自患者CRUKP9145的10个肿瘤样本（5个原发肿瘤样本和5个转移瘤样本），以及7例三阴性乳腺癌（TNBC）和15例高级别浆液性卵巢癌（HGSC）肿瘤样本。
1.对NSCLC样本进行单细胞全基因组DNA测序，共获得14,994个细胞的数据，其中原发肿瘤9,532个细胞，转移瘤5,462个细胞。
2.TNBC和HGSC数据集分别包含42,009个和19,905个细胞的数据。
1.开发SPRINTER算法： 利用scDNA-seq数据，通过计算复制特异性DNA测序信号、进行复制感知的基因组分割、高灵敏度推断S期细胞、推断不同肿瘤克隆、将S期细胞分配到相应克隆以及推断G2期细胞等6个步骤，实现对S 期 和G2期细胞的准确识别和克隆分配。算法利用已知的基因组区域复制时间信息，结合统计方法，克服了以往方法在S期细胞克隆分配和识别中的局限性。
2.生成基准数据集：采用基于EdU的FACS方法，对来自HCT116结直肠癌细胞系的8,844个二倍体和四倍体细胞进行分选，使其进入不同细胞周期阶段，然后使用DLP+进行测序，以评估算法性能。
3.生物信息学分析：将生成的数据集与人类参考基因组hg19比对，使用标准scDNA-seq管道处理，得到单细胞伪批量BAM文件。应用SPRINTER算法对基准数据集和NSCLC样本数据进行分析，同时应用其他相关方法进行比较。
4.系统发育和转移播种分析：利用SNVs和CNAs对NSCLC数据集中的克隆进行肿瘤系统发育重建，采用三步法整合并扩展现有方法，包括使用伪批量方法和概率模型推断每个克隆中的SNVs，使用HUNTRESS算法重建SNV进化，使用MEDICC2算法重建CNA进化，并基于此应用MACHINA算法推断转移迁移模式和识别播种克隆。
5.识别克隆特异性ART：基于SPRINTER的结果，通过比较克隆与正常细胞的复制时间分类，识别肿瘤克隆中的克隆特异性ART，并通过整合匹配的批量RNA测序数据进行基因集变异分析和差异基因表达分析，以支持ART分类。
6.分析ctDNA：利用先前研究中患者CRUKP9145的ctDNA数据，将跟踪的SNVs与SPRINTER识别的单细胞克隆进行匹配，计算每个克隆的ctDNA脱落指数，以评估克隆增殖与ctDNA脱落的关系。
7.计算克隆特异性基因组变异率：在TNBC和HGSC数据集中，根据先前研究中识别的变异，计算单个细胞中克隆特异性SNVs、SVs和CNAs的比率，并根据推断的S分数将克隆分为高增殖和低增殖两组，比较两组间变异率的差异。
8.分析高增殖克隆中的基因组改变：采用假设检验方法，识别TNBC和HGSC数据集中高增殖克隆中富集的已知癌基因扩增、肿瘤抑制基因缺失和驱动突变，并进行基因集富集分析。
图1 SPRINTER算法
SPRINTER算法性能优异：
（1）在识别S期细胞方面，SPRINTER优于CCC和MAPD等先前方法，在中晚期S期识别上准确率提高10%-90%，且在不同倍性细胞混合的数据集中表现稳健，能准确识别G2期细胞；
（2）能准确区分克隆间的增殖率差异，所需复制细胞数量少，在克隆分配上准确性高，可准确推断S期细胞的CNAs。
肿瘤克隆增殖存在异质性：
（1）在NSCLC样本中，不同样本间及样本内克隆间增殖率存在广泛差异，且SPRINTER的克隆特异性估计能发现这些差异，而传统的整体估计方法（如Ki-67分析）则无法做到；
（2）利用Ki-67分析、DLP+核成像和临床成像等正交方法验证了SPRINTER结果的可靠性，如Ki-67染色与SPRINTER的增殖估计总体一致，SPRINTER的相位预测与核直径相关，其估计的平均S分数与肿瘤生长率相关。
增殖与转移相关：
（1）在NSCLC患者中，高增殖克隆具有更高的转移播种潜力，如第三个转移性分支包含最增殖的克隆，且是唯一包含额外播种克隆的分支，其播种遗传距离与S分数呈负相关；
（2）在TNBC和HGSC数据集中，高增殖克隆中细胞的单克隆特异性SNVs、SVs和CNAs比率显著高于低增殖克隆，且与细胞分裂相关的基因改变在高增殖克隆中富集，如CDK4和EGFR等癌基因扩增；
（3）高增殖克隆的ctDNA脱落指数更高，表明其与ctDNA脱落相关。
增殖与ART相关：
（1）在NSCLC中，最增殖和传播的转移性分支存在特定的ART事件（如KRAS的晚期到早期ART），且与基因表达变化相关，尽管未发现该分支特有的遗传驱动因素，但ART为癌症进展提供了一种非遗传进化机制。
图2 SPRINTER改进了S期鉴定，并实现了S期细胞的准确克隆分配
图3 SPRINTER鉴定NSCLC患者CRUKP9145的肿瘤克隆增殖异质性
图4 SPRINTER揭示了克隆增殖和转移播种之间的联系，以及存在于不同转移分支中的克隆特异性ART
1. 开发了SPRINTER算法，能准确识别和分配肿瘤克隆中的S期和G2期细胞，评估克隆特异性增殖率。
2. 揭示了肿瘤内克隆间增殖率的异质性，高增殖克隆具有更高的转移播种潜力、特定基因改变和ctDNA脱落能力。
3. 发现增殖与ART相关，为研究癌症进展的非遗传机制提供了方法。
文献来源：
Lucas O, Ward S, Zaidi R, Bunkum A, Frankell AM, Moore DA, Hill MS, Liu WK, Marinelli D, Lim EL, Hessey S, Naceur-Lombardelli C, Rowan A, Purewal-Mann SK, Zhai H, Dietzen M, Ding B, Royle G, Aparicio S; TRACERx Consortium; PEACE Consortium; McGranahan N, Jamal-Hanjani M, Kanu N, Swanton C, Zaccaria S. Characterizing the evolutionary dynamics of cancer proliferation in single-cell clones with SPRINTER. Nat Genet. 2024 Nov 29. doi: 10.1038/s41588-024-01989-z. Epub ahead of print. PMID: 39614124.
文献链接：
https://www.nature.com/articles/s41588-024-01989-z
分享者简介 ✦
重庆大学智能肿瘤学教育部医药基础研究创新中心2024级生物与医药硕士
编辑|曾海蓉 李劲
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