单细胞刻画免疫微环境如此之火，我们还能玩点什么新花样

近期发表在 Gut（23.0/Q1） ，题目为“ 单细胞综合分析破译胆囊癌发病机制中的微环境动态和免疫调节因子嗅动素4 Comprehensive single-cell analysis deciphered microenvironmental dynamics and immune regulator olfactomedin 4 in pathogenesis of gallbladder cancer ”的文章，作者利用单细胞转录组分析揭示了胆囊疾病在不同病理状态下的免疫环境变化。研究通过体外体内双重实验验证OLFM4这个关键致癌因子，并且它是可以通过血液检测获取的，这为临床应用提供很大的帮助，因为它好用还易获得！！！

研究对象： 胆囊疾病

目的： 阐明GBC和良性胆囊疾病的复杂生态系统和分子特征。

方法： 15个GBC、4个胆囊炎、3个胆囊息肉、5个胆囊腺瘤以及16个Control的单细胞转录组分析，大规模组织学分析、数字空间分析、多重免疫荧光体外体内研究进一步阐明分子机制。

PS： 胆囊炎、胆囊息肉和胆囊腺瘤均有可能与胆囊癌的发生有关，尤其是在持续的慢性炎症和大型息肉存在的情况下。

结果

一、单细胞测序鉴定出多种组织谱系状态和细胞群

27 例患者的 43 个临床样本进行了 scRNA-seq 分析，其中包括 4 例胆囊炎 (GC)、3 例胆囊息肉 (GP)、5 例胆囊腺瘤 (GA) 和 15 例 GBC（1 例鳞状细胞癌，SCC；2 例腺鳞癌，混合型；和 12 例 AC），以及 16 例匹配的邻近正常组织ANT 由表及里的分析不同类型的胆囊疾病以及不同亚型的胆囊癌患者的细胞组成（图1），结果发现不同类别的胆囊疾病在细胞组成和细胞周期上存在差异。 强调恶性癌症相关细胞组成倾向于免疫抑制性免疫细胞（调节性T细胞和CD8+ 耗竭性T细胞），暗示癌症中的免疫逃逸。

图1 43个样本的scRNA-Seq呈现胆囊癌前病变和胆囊癌概况

二、胆囊疾病发病机制中免疫细胞亚群模式的改变

基于上述分析的结果，已经暗示了癌症中的免疫逃逸，因此接下来重点分析淋巴细胞亚群（14个，图2A），并进行TCR分析（图2B）。结果发现在GBC中CD8-Tex具有更多的TCR克隆扩增（图2D）。与 CD8-Tex 具有相同 TCR 克隆型的细胞在 CD8-Teff、CD8-Trm、CD8-Tem和 CD3-Cycling 中富集（图2E），这暗示可能存在相同的起源（图2F）。此外通过多重免疫组化对数据分析结果得到验证（图2G-I）。研究还发现，巨噬细胞在GBC和癌前病变中也具有多样性，具体表现为GBC（Macro-CCL18、Macro-CXCL10、Macro-MT1G、Macro-SPP1）以及癌前病变（Macro-C1QC、Macro-LYVE1、Macro-RGS16）中表现出增多的M2型、抗炎、血管生成和免疫检查点阻断（ICB）功能的亚型（图2J-N）。总体而言，淋巴细胞的异质性与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的核心基因对GBC的产生和进展至关重要。

图2 整个疾病进展过程中免疫细胞状态的表征

三、GBC进展过程中基质细胞的可塑性和重塑性增强

基于胆囊本身的特点，富含胶原，基质明显，因此接下来分析胆囊疾病不同病理过程的基质细胞（成纤维细胞、内皮细胞和其他细胞类型）异质性（图3A-B）。相关性分析表明基质细胞和免疫细胞（绿框）之间的相互排斥性，与成纤维细胞内皮细胞（黄框）存在细胞间相互作用（图3C）。

为了了解基质细胞亚群内的表型多样性，研究对细胞组成进行量化，确定了三种不同的基质生态系统（SC）。肿瘤样本中主要出现的为SC1（Fibro-iCAF、Endo-Tip 细胞和周细胞组成）和SC3（成纤维细胞）；非肿瘤样本中主要是SC2（内皮细胞组成；图3D）。进一步，通过TCGA队列和GBC的bulk RNA-Seq数据分析，发现SC1是患者预后较差的潜在特征（图3F-H）。这些结果强调了胆囊疾病中特有的基质-免疫细胞增强的互作尤其是Fibro-iCAF 和 Endo-Tip 细胞之间的相互作用，患者预后更差。

图3 基质细胞的表型丰度和相互作用

四、上皮细胞的复杂分子特征以及GA和AC之间的进化相似性

基质细胞异质性要高于免疫细胞（图4A）。通过非负矩阵分解确定了AC样本中8个不同生物活性的功能模块（RNA剪接、氧化磷酸化、细胞周期、上皮分化、免疫相关基因、应激反应、内分泌相关基因和上皮-间质转化；图4C）。这种分类揭示了AC之间的异质性，为精准治疗提供帮助。进一步拟时序分析提示Epi-SAA1可能在促进从非恶性上皮到恶性上皮转变中起关键作用（图4F）。拟时序分析细胞命运和功能富集表明 GA 和 AC 具有潜在的进化相似性（图4 G）。

图4 上皮细胞亚型重新细胞分化特定基因的表达动态

五、OLFM4在GBC恶性上皮中升高

在上皮细胞分化轨迹中，研究发现波形蛋白（VIM）和OLFM4在伪时间进程中按时间顺序增强，尤其是细胞命运2（朝向GBC发展的轨迹；图4H）。OLFM4在恶性上皮、Epi-SAA1中高表达，同时通过多重IHC也证明了AC上皮中高表达的OLFM4（图5A-C）。此外与癌旁组织相比，肿瘤中OLFM4明显增加（图5D）。免疫组化染色结果也表明OLFM4-high组预后明显差（图5E-F）。接下来为了能让研究结果落地，作者又分析了血浆中OLFM4在不同胆囊疾病中的水平，结果非常符合预期的在肿瘤中显著的高（图5G）。这意味着可以通过抽血检验来提前进行具有胆囊癌病变倾向的筛查。

图5 OLFM4随GBC进展而高表达，可在外周血中检测到

六、OLFM4阳性的GBC中TAM互作增强，PD-L1信号传导增强

通过GeoMx DSP技术，对90个样本（OLFM4+（n=58）和OLFM4-（n=32））进行特定区域蛋白质表达水平量化，结果发现OLFM4+组PD-L1、CD163和纤连蛋白上调，而STING下调（图6C），OLFM4+细胞比例与TAM和PD-L1信号传导呈正相关（图6E）。研究通过使用异种移植模型证明了OLFM4敲低细胞肿瘤大小显著小于对照组（图6F-G），研究从高通量数据出发，获得结论在异种移植模型实验得到验证，层层递进说明OLFM4在肿瘤细胞通过与TAM之间的互作来调节T细胞功能进而影响GBC中的免疫反应。

图6 OLFM4与TAM浸润程度呈正相关，抑制抗肿瘤T细胞免疫

七、OLFM4通过MAPK-AP1轴上调PD-L1来削弱免疫反应

在已经摸清OLFM4通过TAM互作来调控免疫强弱之后，进一步去探索这背后的机制，研究对异种移植模型中OLFM4敲低与对照样本进行了RNA-Seq测序，结果发现敲低组编码PD-L1的CD274基因显著下调，同时通过WB实验也证明在蛋白层面PD-L1也降低（图7A-C）。这里作者还发现OLFM4调控PD-L1的作用已经在多个癌细胞系中发现，这就表明OLFM4可能显著影响着除GBC以外的其余癌症的PD-L1表达。接下来又通过T细胞介导杀伤实验来探索PD-L1是否影响T细胞功能。与OLFM4敲低的GBC细胞一同培养时，细胞毒性T细胞活性增强（图7D-F）。与OLFM4敲低的外周血细胞一同培养时，凋亡肿瘤细胞增加（图7G-H）。给予Atezolizumab治疗，敲低组并未表现出IFN-γ分泌增加（图7I-J）。接下来通过WB实验证明了OLFM4敲低组MAPK通路内p-ERK1/2和p-MEK 1/2表达显著降低，下游转录因子AP-1和靶基因PD-L1的蛋白水平也降低了（图7L）。这些体内体外实验强调了OLFM4在激活PD-L1轴并抑制GBC（可能不限于）的T细胞功能中的关键作用。

图7 OLFM4通过MAPK-AP1-PD-L1轴来削弱免疫反应

补充知识点：

1、GeoMx DSP是一种先进的数字空间分析技术，它和空间转录组血都是用于分析组织中分子分布的先进技术，它们有着相似的目的、但在原理、方法和应用上有所不同。GeoMx DSP侧重于特定区域或细胞类型的RNA和蛋白质的高通量、多重分析。它允许研究人员选择组织切片中特定感兴趣区域（ROIs），然后定量分析这些区域内的RNA或蛋白质表达；空间转录组学主要集中在全基因组范围内的mRNA表达水平和空间分布。能够在整个组织切片上生成每个基因的表达谱，而无需预先选择特定区域。

2、CD4-Tfh：滤泡辅助性T细胞，主要在B细胞滤泡中发挥作用，帮助B细胞进行抗体生成和类开关重组。

3、CD4-Treg：调节性T细胞，维持免疫耐受的重要细胞亚群。增加的Treg细胞活性肯呢个有助于治疗自身免疫疾病，而在肿瘤中，抑制Treg可能增强抗肿瘤免疫应答。

4、CD8-Tex：衰歇的CD8+ T细胞，它表现出降低的增殖能力、细胞毒性以及细胞因子的产生。

5、CD3-Cycling：周期性T细胞，指正在经历细胞周期的T细胞，这些细胞通常处于增殖状态，表现出分裂相关的特征。

6、CDR3 length：位于TCR和BCR抗原结合部位，相比于来自于基因片段的CDR1和CDR2，CDR3通过基因重拍过程中引入的随机核苷酸变化生成，因为具有最高的多样性。

7、CD8-Teff：活化后的CD8+ T细胞。

8、CD8-Trm：组织驻留基因CD8+ T细胞。

9、CD8-Tem：效应基因CD8+ T细胞，是记忆T细胞的一种，保留了一部分Teff细胞的功能，可以更快的分化成效应细胞以应对病原体。

10、cCD3：胞浆CD3，是CD3分子在细胞浆中的存在形式。CD3是TCR复合物的一个组成部分，在T细胞的发育和功能中起着关键作用。

11、抑制性的免疫微环境：是指一种在肿瘤或受损组织周围形成的微环境，能够抑制或削弱集体的免疫反应。这种微环境通常由肿瘤细胞、基质细胞、免疫抑制细胞（调节性T细胞、髓源性抑制细胞等）、细胞因子和其他分子组成，能够共同作用来抑制抗肿瘤免疫反应，帮助肿瘤逃避免疫系统的攻击。

12、基质细胞：存在与组织间质的非肿瘤细胞，主要为支持和连接组织提供结构和功能支持（成纤维细胞，产生于细胞外基质eg胶原蛋白和纤维连接蛋白；血管内皮细胞，参与血管生成；免疫细胞，包括巨噬细胞淋巴细胞和中性粒细胞；平滑肌细胞，位于血管周围，为血管提供支持，并调节血流；间充质干细胞，可以分化为多种类型细胞，在组织修复和免疫调节中发挥作用。

13、基质生态系统：TME中的复杂网络，由基质细胞、细胞外基质ECM、信号分子（生长因子、细胞因子）以及其他非细胞成分组成，这些组分通过相互作用，调控肿瘤成长、侵袭、转移和免疫逃逸）

图8 研究中胆囊疾病的免疫特征和生态系统动态总结