从良性到侵袭：探索黑色素瘤细胞的转变之路

一、背景介绍

良性和恶性的黑色素瘤细胞具有不同的形态特征和临床预后[1]。良性的黑色素瘤细胞会静止在其组织微环境中，而恶性的黑色素瘤细胞具有增殖，入侵周围临近组织和转移能力。恶性黑色素瘤细胞中含有大量的与良性黑色素瘤细胞不同的致癌突变[2]。除了单个DNA突变之外，黑色素瘤患者的临床命运还与肿瘤微环境中尚未被人完全理解的细胞机制，分子和遗传特征的组合关联。

由于目前科研人员对黑色素瘤生物学和基因表达的理解多是基于RNA测序技术，如微矩阵测序，单细胞测序手段，然而这些技术缺少空间表达信息，因此无法解析诸如细胞间邻域等关联。尽管已有研究揭示了黑色素瘤细胞增殖和侵袭相关基因表达图谱[3]，但是这种表型在肿瘤微环境中的空间分布特征，以及具体的调节作用目前仍然知之甚少。

在这项研究中，作者使用基于单细胞RNA分辨率的空间分子成像技术（RNA-SMI），绘制了良性、恶性及转移性黑色素瘤细胞中基因表达的单细胞图谱，进而确定了影响黑色素瘤患者生存进展的增殖基因特征。

二、主要结果

1、基于单细胞RNA的良性、恶性及转移性黑色素肿瘤细胞基因表达图谱

作者通过RNA-SMI技术解析了203,472个黑色素瘤细胞，样本包括3例良性黑色素瘤、4例恶性黑色素瘤和3例转移性黑色素瘤患者的标本。随后，作者对已知的良性黑色素瘤细胞、恶性黑色素瘤细胞及转移性黑色素瘤细胞的相关基因表达进行了比较。研究发现，与良性黑色素瘤相比，转移性黑色素瘤中已知的黑色素瘤标记基因PRAME的表达显著增加。

UMAP结果表明S100B阳性细胞（推断为恶性黑色素瘤细胞）同时高表达PRAME基因，以及KRT14阳性细胞（推断为覆盖在黑色素瘤上的角质细胞）同时高表达S100A8基因。 这些以及其他候选基因的UMAP结果表明，样本数据集适用于进一步提取不同病变类型之间的有意义的基因表达特征（图1）。

图 1：基于单细胞R NA - SMI 的良性，恶性及转移性黑色素瘤图谱

2、聚类分析鉴定出包括CDK2在内的增殖基因特征

增殖相关基因表达特征如何影响着黑色素瘤进展呢？为了探究这一问题，作者对203772个细胞进行Leiden无监督聚类分析，所有细胞被划分为11个细胞亚群之后，作者将这些细胞亚群映射到组织样本中。作者通过参考人类细胞图谱黑色素瘤单细胞数据集，对11个细胞亚群进行细胞类型注释，注释结果将黑色素瘤细胞显著的划为了一簇。

作者检测了与细胞增殖最相关的基因表达如MKI67和CENPF，结果发现这些基因在聚类后的细胞亚群8中最高表达，同时该亚群高表达黑色素瘤相关基因如CDH1，MITF转录调控因子CDK2，生长因子AKT等。在UMAP结果中，作者发现细胞亚群h（Tumor cluster h）同时高表达MKI67及其他增殖细胞标志物如CDH1，CDK2，并在转移性黑色素瘤中显著富集，尤其是在经历活跃细胞周期代谢的细胞内。

在检测与MKI67最相关的增殖基因表达过程中，作者发现细胞增殖标记CENPF与MKI67呈正相关，而非增殖性黑色素瘤标志PRAME与MKI67无明显相关性。 CDK2在基因和蛋白表达水平均与MKI67呈现正相关，这些相关性在癌症基因图谱中的黑色素瘤患者临床数据集中也得到了证实（图2）。

图 2 . 聚类分析鉴定出包括 C DK2 在内的增殖基因特征

3、CDK2在肿瘤-基质边缘的差异表达特征

由于CDK2具有与MKI67表达的高度相关性，在黑色素瘤中上调表达的特异性以及其作为MITF下游转录靶点的特殊功能，作者决定探究其在良性和恶性黑色素瘤中的空间表达模式。

有意思的是，作者发现CDK2在真皮-表皮交界处的良性黑色素瘤细胞中富集表达。然而，真皮深层中CDK2的表达在良性和恶性黑色素瘤之间存在巨大差异。在皮内良性黑色素瘤中，CDK2的表达随着真皮深度的增加而逐渐降低，而在原发性黑色素瘤中，CDK2在肿瘤-基质交界处的表达保持在相对较高的水平。在59个皮内痣和69个原发性黑色素瘤患者组成的样本集中，作者也在蛋白质表达水平上证实了CDK2的表达与黑色素瘤的侵袭程度以及患者较差的临床预后相关。在量化数据集中CDK2的表达与其他原发性黑色素瘤特征基因之间的差异过程中，作者发现CDK2的上调表达特征与PRAME非常相似。

总的来说，以上结果表明在肿瘤-基质边界相对较高的CDK2表达可以作为大多数原发性黑色素瘤的一个特征。然而，CDK2表达本身并不是恶性黑素细胞肿瘤的标志，因为它也在某些良性黑色素瘤细胞中表达。 这一矛盾暗示在良性和恶性肿瘤环境中，还存在其他空间上确定的调节细胞表型的因素（图3）。

图 3. 黑色素瘤肿瘤基质交界处的 C DK2 表达特征

4、肿瘤内增殖和代谢相关基因表达的空间特征

为了发现可以区分良性与恶性黑色素瘤细胞的肿瘤微环境因素，作者直接比较了良性和高表达CDK2的恶性黑色素瘤细胞间基因表达特征。通过组织形态学和免疫组织化学对典型的良性和恶性黑色素瘤进行鉴定，作者发现CDK2和PRAME的表达特征与鉴定的良性和恶性黑色素瘤所对应，同时与恶性肿瘤细胞相关的角化细胞高表达S100A8。

作者使用Lee 's L空间关联分析来评估恶性肿瘤中的基因表达，通过检测基因在空间中的表达相关性，最终确定了四个不同的基因模块，它们在肿瘤的恶性部分中具有不同的表达模式。如模块3表现出炎症和免疫调节基因的上调表达，包括HLA-A，HLA-B及BST-2等，这提示该模块所在的空间区域可能会引发相对较大的先天免疫反应。

作者发现CDK2高表达的模块4与细胞增殖之间的关联最为显著。双免疫荧光组织化学检测也发现CDK2和Ki-67在蛋白水平上的共表达特征。值得注意的是，模块4同时高表达调节癌症促生长代谢相关基因COX5B和FABP5。将这些调控基因映射到肿瘤组织中间接证实了它们的空间表达差异模式。 总之，这些分析揭示了单个异质性肿瘤微环境中不同的空间基因表达特征，并揭示了与恶性黑色素瘤进展相关的潜在基因（图4）。

图 4 . 肿瘤内空间分析 增殖 和代谢相关基因表达特征

5、MKI67、CDK2和FABP5的差异表达可回顾性预测黑色素瘤患者的预后

为了探索临床相关的黑色素瘤标志物，作者尝试利用RNA-SMI空间基因表达图谱构建黑色素瘤生存的基因模型，并在TCGA中的473例黑色素瘤患者进行COX回归分析验证，包括RNA-SMI中发现的在恶性黑色素瘤高表达的MKI67，CENPF，CDK2，CDH1，COX5B以及FABP5。除了PRAME以外，其他生物标志物均表现显著区分黑色素瘤患者生存预后的能力，其中MKI67表达增加与患者生存率降低显著相关，而CENPF没有该现象。

作者进一步在数据集中检测了MKI67、CDK2和FABP5在肿瘤微环境中的共表达模式。UMAP结果中，作者发现MKI67/CDK2/FABP5在恶性和转移性黑色素瘤细胞簇中富集。RNA-SMI转录本的结果显示CDK2和FABP5在皮肤转移性黑色素瘤相比良性黑色素瘤中的表达增加，这一结果在蛋白质水平也得到了证实。此外，非病变皮肤的表皮上层，也发现了显著的FABP5表达。作者认为这种表皮表达特征可能有助于解释为什么FABP5最初没有被聚集在富含黑素细胞的增殖模块中，进而说明了空间分析对肿瘤探索的实用性。

最后。为了在机制中解释MKI67，CDK2和FABP5在周期细胞中的表达关系。作者对使用二甲基亚砜（DMSO）或CDK4抑制剂处理后的黑色素瘤单细胞数据集进行分析比较。与对照组相比，处理后的细胞增殖标志物MKI67表达丧失；与DMSO处理组相比，CDK4抑制剂处理组中未观测到CDK2表达减少，但FABP5表达略微降低。 作者认为，这些结果说明CDK2表达在增殖细胞的上游，而FABP5表达水平可能代表了在转移进展过程中增殖状态的黑色素瘤细胞对环境的适应性反应（图5）。

图 5. M KI67 ， C DK2 及 F ABP5 回顾性预测黑色素瘤患者预后

三、讨论

总之，在这项研究中，作者使用单细胞RNA-SMI分析检测技术对10例不同程度的黑色素瘤患者进行了谱系分析，重点关注了黑色素瘤中增殖细胞相关的基因表达模式与不同程度的黑色素瘤进展之间的关系，发现了其中CDK2和FABP5在恶性黑色素瘤中与MKI67可能存在于同一代谢信号上下游，其高表达与恶性黑色素瘤的的侵袭和转移相关。

在小编看来，这项研究可能是受限于样本量较少以及检测到较少基因表达（1000左右）的缘故，限制了作者想进一步在更广，更深程度的相关机制探究。总体给人一种浅尝辄止的感觉。尽管当前研究存在一定的局限性，但它为黑色素瘤领域的科研人员指明了新的研究方向，期待后续能有更深入的研究成果。

参考文献

[1] YEH I, BASTIAN B C. Melanoma pathology: new approaches and classification [J]. Br J Dermatol, 2021, 185(2): 282-93.

[2] YEH I. Update on classification of melanocytic tumors and the role of immunohistochemistry and molecular techniques [J]. Semin Diagn Pathol, 2022, 39(4): 248-56.

[3] WIDMER D S, CHENG P F, EICHHOFF O M, et al. Systematic classification of melanoma cells by phenotype-specific gene expression mapping [J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2012, 25(3): 343-53.