Genome Biol | 突破传统直接RNA测序局限！新方法可同时检测多类ncRNA和mRNA

近日，加拿大曼尼托巴大学的科研团队在 Genome Biology 发表了题为”NERD-seq: a novel approach of Nanopore direct RNA sequencing that expands representation of non-coding RNAs”的文章。 研究团队提出了一种名为NERD-seq的方法，扩展了标准直接RNA-seq的应用范围，能够在全基因组范围内检测多种ncRNA类型，同时保持了对高复杂性mRNA转录组的测序能力 。使用神经组织作为验证，该研究证明NERD-seq技术扩展了频繁修饰ncRNA的表征，包括snoRNA、snRNA、scRNA、srpRNA、tRNA和rRF等。综上， NERD-seq能够同时研究脑组织及其他组织中的mRNA和ncRNA表观转录组 。

标准的直接RNA-seq方法依赖于poly(A)选择，可对poly(A)转录组（主要是mRNA）进行测序，但无法有效检测没有poly(A)尾的短ncRNA。 为改善这一局限性，同时保持对poly(A)转录组进行测序的能力，研究团队开发了一种名为NERD-seq的非编码富集RNA直接测序方法 （图1）。

该方法利用柱基大小富集将总RNA分为长RNA和短RNA两部分，短RNA部分通过poly(A)聚合酶添加poly(A)尾部，使其能够与poly(T)测序接头蛋白形成碱基配对，从而提高短RNA纳米孔测序的准确性；长RNA部分则保留全长rRNA，避免多聚腺苷酸化；在灭活poly(A)聚合酶后，将两个部分（短和长RNA）再次聚集在一起。

此外，为克服高度结构化RNA区域在测序过程中的阻碍，研究团队使用GspSSD 2.0 DNA聚合酶改进了互补链的合成。经验证， NERD-seq能够同时富集短ncRNA、mRNA和长ncRNA，而不会产生显著的poly(A)长度偏差 。

为评估NERD-seq的潜力，研究团队利用从小鼠海马体提取的总RNA，对NERD-seq和标准直接RNA-seq测序结果进行了比较（图2）。结果显示， 与标准直接RNA-seq方法相比，NERD-seq能够有效富集较短的非poly(A)RNA，可提供更多的信息，证明了该方法在神经组织RNA测序中的应用潜力。

研究团队通过NERD-seq技术对基因组元件进行了测序reads分析，发现与标准直接RNA-seq方法相比， NERD-seq在编码区和非编码区的reads分布有显著差异 。标准直接RNA-seq主要关注编码区，尤其是已知外显子；而 NERD-seq能够生成更多、具有更高覆盖度的非编码区reads 。与标准方法相比，LINE是NERD-seq中代表性过剩的主要非编码元件之一。

除生成覆盖度更高的非编码基因组reads外， NERD-seq还能有效检测mRNA和 poly(A) ncR NA 。经验证，NERD-seq能够检测到 转录起始位点（ TSS）下游reads分布中峰值所记录的mRNA； 在小鼠中NERD-seq成功检测到由SINE元件B2产生的全长 poly(A) ncRNA（B2 RNA），并 在人类大脑皮层组织中检测到 丰富的、与人类B2 RNA同源的Alu SINE RNA。 特别地，NERD-seq还能像标准方法一样分析mRNA的剪接模式。

为评估NERD-seq能否检测已知类型的非poly(A) ncRNA，研究团队生成了四类ncRNA（snoRNA、snRNA、scRNAs和srpRNA）的TSS周围相对reads密度分布图，并与标准方法和外部直接RNA-seq数据进行比较（图4）。结果显示， 只有NERD-seq为所有四个类型ncRNA生成了稳健的分布 。

来自LINE的ncRNA在预防神经退行性疾病中具有重要作用，研究团队将通过NERD-seq和标准方法产生的reads映射到LINE元基因上，以识别LINE元件中的热点。 与标准文库相比，NERD-seq数据中映射到LINE元件的reads更加丰富 ； 在NERD-seq检测到的所有主要LINE元件中， 来自LINE L1家族的reads覆盖率最高 。这些结果表明， NERD-seq技术能够检测到源自LINE元件内部的ncRNA，并能从测序reads中提取更多无法通过标准方法获得的信息 。

为评估NERD-seq生成的数据在检测RNA修饰方面的有效性，研究团队使用来自合成构建体的人类7SK基因进行体外转录（IVT），并将其与通过标准和NERD-seq方法从人类大脑皮层（5个供体）测序的总RNA进行比较。 与标准测序方法相比， NERD-seq无需使用独特的adapter便能捕获更多的7SK reads 以及其他多种RNA分子 。

此外，研究团队还观察了GRCh38参考基因组中的rn7SK基因组区域， 确认了尿嘧啶250处的假尿苷位点存在强烈的T/C错配；并发现了可能的肌苷位点和APOBEC底物相关的错配位点 。

上述结果表明， NERD-seq方案在分析RNA修饰和表观转录组特征方面具有潜在的优势，在不需要特殊adapter 的情况下能够捕获更多的RNA分子 。

综上所述，研究团队提出了一种名为NERD-seq的 非编码RNA直接测序方法 ，该方法改进了标准的直接RNA测序文库技术，能够同时富集和捕获多种类型的ncRNA和mRNA。通过量化重要ncRNA类型的相对富集， 研究团队 证明了NERD-seq的效用，并评估了snRNA的表观转录组标记。总的来说，NERD-seq能够促进许多重要的ncRNAs相关研究，将其与mRNA的标准分析相结合可使转录组和表观转录组分析更加全面。