“秋水仙碱”新发现！重庆医科大学发文：发现肝炎及肝癌治疗新策略
【导读】 乙型肝炎核心蛋白（HBc）是乙型肝炎病毒的一种重要病毒蛋白，在乙型肝炎病毒的生命周期中发挥着不可或缺的作用，包括病毒衣壳的组装和运输、逆转录和病毒释放。近年来的研究表明，HBc可能参与了肝癌的恶性进展。因此，HBc成为抗病毒药物的有吸引力的靶点，为治疗与乙型肝炎病毒相关的肝癌提供了新的策略。
8月6日，重庆医科大学研究团队在期刊《Cell Death Discovery》上发表了题为“Colchicine-mediated selective autophagic degradation of HBV core proteins inhibits HBV replication and HBV-related hepatocellular carcinoma progression”的研究论文，本研究中，研究人员发现了一种新的抗HBc化合物-秋水仙碱，一种生物碱化合物，通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进HBc的选择性自噬降解。研究人员进一步证实秋水仙碱通过增强HBc与自噬受体p62的结合来促进HBc的选择性自噬。最后，研究人员在体外和体内评估了秋水仙碱对HBV复制和HBV介导的HCC转移的影响。 本研究表明秋水仙碱对HBV和HBV相关HCC的抑制作用依赖于HBc的选择性自噬降解。因此，秋水仙碱不仅是一种很有前景的治疗慢性乙型肝炎的策略，而且是一种新的治疗HBV相关HCC的方法。
https://www.nature.com/articles/s41420-024-02122-z
背景知识
01
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性健康问题，不容忽视，在全球范围内导致超过一半的肝细胞癌（HCC）病例。尽管近年来已开发出有效的预防性疫苗，但慢性HBV感染仍难以治愈。目前治疗慢性HBV感染的药物包括干扰素-α及其聚乙二醇形式以及长期核苷（酸）类似物（NUCs）。这两种方法都导致HBsAg清除率极低。迫切需要开发新的药物来提高慢性HB感染的治愈率。
乙型肝炎病毒（HBV）含有3.2kb的DNA，是一种嗜肝DNA病毒。HBV基因组由双链不完整的环状DNA组成，可以在感染细胞的核内形成共价闭合环状DNA（cccDNA），并进一步转录和翻译产生病毒蛋白，包括病毒聚合酶（HBp）、X蛋白（HBx）、包膜蛋白（HBs）、HBeAg和核心/衣壳蛋白（HBc）。针对病毒蛋白治疗乙型肝炎已成为研究热点，HBc靶向化合物的发展已成为潜在方向。
HBc是一种21千道尔顿的蛋白质，参与病毒核衣壳的形成，在病毒衣壳装配和运输、逆转录和病毒释放方面发挥着重要作用。最近有报道称，核心蛋白的变构调节可以抑制HBV复制和新的cccDNA形成。然而，HBc的作用并不局限于HBV。近年来发现，HBc在HCC的恶性转化中发挥着重要作用，并且发现HBc参与了与细胞增殖和迁移相关的细胞信号通路的激活。因此，HBc是抑制HBV和HBV相关HCC的有吸引力的靶点。
生物碱是含有环状结构的有机化合物，其中至少含有一个碱性氮原子，常用于治疗传染病和抗病毒药物。在这项研究中，研究人员通过一种新型筛选策略对生物碱化合物库进行筛选，发现了一种新型抗HBc化合物——秋水仙碱。此外，研究人员阐明了秋水仙碱（Col）促进p62受体与HBc结合并诱导HBc选择性自噬降解的分子机制。鉴于HBc在HBV复制和HCC转移过程中的双重作用，本研究为阐明秋水仙碱抑制HBV复制和HBV相关HCC转移的机制提供了更深入的见解。
秋水仙碱体外抗HBV作用的研究
02
由于秋水仙碱显著降低HBV复制所必需的HBc蛋白水平，研究人员接下来评估了秋水仙碱对HBV转录和复制的影响。HepG2-NTCP细胞感染HBV后，用不同浓度秋水仙碱处理。Real-time PCR显示秋水仙碱明显降低HBV RNA水平，RNA印渍术进一步证实了这一点。接下来，为了探索秋水仙碱对HBV DNA的影响，研究人员使用恩替卡韦(ETV)作为阳性对照，恩替卡韦是一种核苷类似物，可以有效抑制HBV DNA复制。虽然秋水仙碱的效果不如ETV，但实时PCR和DNA印迹术显示，秋水仙碱治疗后HBV DNA水平呈剂量依赖性下降。此外，秋水仙碱处理后，cccDNA水平保持稳定。另外，研究人员还确定了秋水仙碱治疗对HBV蛋白水平的影响。秋水仙碱暴露的细胞HBeAg和HBsAg分泌明显减少。同样，通过蛋白质免疫印迹和荧光染色检测，秋水仙碱处理显著降低了HBc水平。综上所述，秋水仙碱对HBV具有明显的抑制作用。
秋水仙碱在体外抑制HBV转录和复制
为了探究秋水仙碱对HBV转录和复制的影响是否由HBc介导，研究人员构建了一个缺失C基因表达的HBc质粒(HBV-ΔHBc)。用WT HBV或HBV-ΔHBc质粒转染Huh-7细胞，检测一系列HBV标志物(S6A-B)。数据显示，秋水仙碱可以有效降低转染HBV- wt的细胞中的HBV RNA水平，但不能降低转染HBV-ΔHBc质粒的细胞中的HBV RNA水平。同样，秋水仙碱在这些条件下也没有降低HBsAg水平。另外，使用Flag-HBc恢复转染HBV-ΔHBc质粒的细胞中的HBc水平，并观察BafA1对col介导的HBV抑制的作用。在转染Flag-HBc的细胞中观察到HBV RNA水平明显下降，而这种下降被BafA1所消除。而且，在转染Flag-HBc的细胞中，BafA1逆转了秋水仙碱处理引起的HBsAg水平下降。此外，研究人员评估了秋水仙碱对HBV转录的抑制是否取决于HBV感染系统中的HBc。研究人员发现，自噬抑制剂BafA1显著减弱了Col处理细胞中HBV RNA水平的降低。同样，秋水仙碱对HBV DNA的影响也被BafA1处理所消除，HBV DNA对HBeAg、HBsAg和HBc水平的影响也被消除。这些数据证实秋水仙碱可以通过自噬降解HBc抑制HBV的转录和复制。
秋水仙碱抑制乙型肝炎介导的肝癌转移
03
HBc在肝癌转移和恶性进展中起重要作用，研究人员进一步研究秋水仙碱在肝癌转移中的作用。首先，研究人员将Flag-HBc转染到Huh-7细胞中，并进行了一系列实验，以确定秋水仙碱对HBc过表达对HCC进展的影响。与转染Vector的Huh-7细胞相比，秋水仙碱显著降低过表达HBc的Huh-7细胞的迁移、侵袭和划痕愈合能力。此外，F-actin染色显示，秋水仙碱处理显著减少过表达HBc的Huh-7细胞板状伪足的形成。
秋水仙碱可抑制HBc介导的肝癌转移
为了探讨秋水仙碱对肝癌体内转移的影响，研究人员构建了稳定表达HBc的Huh7细胞。研究人员发现，在注射Huh7-HBc细胞的小鼠中，与注射Huh7-Vector的小鼠相比，秋水仙碱可有效减少肝脏肿瘤的数量和大小。此外，在注射Huh7-HBc细胞的小鼠中，秋水仙碱处理组小鼠的肺转移数量显著低于对照组小鼠，而在注射Huh7-Vector的小鼠中未观察到这一情况。综上所述，这些数据证实了秋水仙碱在体内和体外均可抑制HBc相关的转移。
研究小结
04
总的来说，本研究建立了双荧光素酶报告实验，并确定秋水仙碱抑制HBc表达，进一步的机制研究表明秋水仙碱促进HBc的选择性自噬降解。本研究表明秋水仙碱是一种潜在的候选药物，可以通过靶向HBc蛋白治疗HBV和HBV相关的HCC。
【参考资料】
https://www.nature.com/articles/s41420-024-02122-z
链接：http://www.lewenyixue.com/2024/08/12/%E2%80%9C%E7%A7%8B%E6%B0%B4%E4%BB%99%E7%A2%B1%E2%80%9D%E6%96%B0%E5%8F%91%E7%8E%B0%EF%BC%81%E9%87%8D%E5%BA%86%E5%8C%BB%E7%A7%91%E5%A4%A7%E5%AD%A6%E5%8F%91%E6%96%87%EF%BC%9A%E5%8F%91/
