NAR | 基于人工智能技术在非编码DNA中发现新型癌症驱动突变

CCCTC结合因子（CTCF）是一种绝缘体蛋白，普遍存在于真核生物中，可与高度保守的DNA基序结合并促进三维（3D）核结构和转录的调节。CTCF结合位点（CTCF-BSs）位于在非编码DNA中，其数量庞大且具有显著异质性，经常在癌症中发生突变。

已知CTCF敲低可导致CTCF-BSs的广泛丧失，称为丢失性CTCF结合位点（L-CTCF-BSs）；先前研究还确定了一小类对CTCF敲低具有抗性的CTCF-BSs，称为持久性CTCF结合位点（P-CTCF-BSs）。与L-CTCF-BSs相比，P-CTCF-BSs表现出不同的遗传和表观遗传特性，具有高度结合保守性，并可能调控细胞型的构成性3D染色质结构。但L-CTCF-BSs的突变频率，以及其能否导致目前仍不清楚。

为解决上述难题， 研究团队开发了一种名为“CTCF-INSITE”的复杂人工智能（AI ）工具，可基于实验定义的P-CTCF-BSs，预测CTCF在癌细胞中敲低后的结合持久性。 值得注意的是，在所有12种癌症类型中，预测的P-CTCF-BSs显示出显著升高的突变负荷；对于预测会对CTCF结合和染色质环产生功能性影响的P-CTCF-BSs突变，其富集程度更加明显。使用体外结合实验，研究团队证实了预测具有破坏性的P-CTCF-BSs癌症突变确实降低了CTCF的结合。综上， 该研究揭示了一类新的癌症特异性CTCF-BS DNA突变，并为其在泛癌症背景下对基因组组织的重要性提供了见解。

研究团队首先评估了实验定义的P-CTCF-BSs的基因组和表观基因组特征，使用机器学习方法预测了CTCF敲低后的结合持久性（图1）。研究团队收集了从3,128名患者肺组织、乳癌和前列腺癌分离的LNCaP、MCF7和IMR90细胞系的综合分子数据集，这些数据包括全基因组测序（WGS）、CTCF ChIP-seq和RNAi介导的CTCF敲低ChIP-seq数据等，将P-CTCF-BSs定义为CTCF敲低后基本不变的CTCF ChIP-seq峰位置，而L-CTCF-BSs则是CTCF ChIP-seq峰丢失的位置。

研究团队依据LNCaP和MCF7细胞系的实验数据，量化了之前研究中的特征以及新特征（n=15）在区分P-CTCF-BSs/L-CTCF-BSs方面的能力。结果显示，排名前3的特征分别是： 每个ChIP-seq峰reads的富集倍数（fold enrichment）、基序评分和组成性结合 。研究团队还观察到，与L-CTCF-BS相比， 更多的P-CTCF-BS位于染色质环锚点、TAD边界、晚期复制时序区域，并具有更高的保守性评分 。

随后，研究团队使用LNCaP数据作为训练集开发逻辑回归和随机森林模型， 利用基因组和表观基因组数据预测P-CTCF-BS，并开发了一个名为CTCF-INSITE的工具 。

研究团队通过将LNCaP和MCF7的CTCF-ChIP-seq峰区域与国际癌症基因组联盟（ICGC）WGS数据（前列腺癌和乳腺癌）中的所有突变进行交叉比对，探究了持久性和突变率之间的关系（图2）。结果显示， 大部分CTCF-ChIP-seq峰区域包含≥1个突变；P-CTCF-BS比L-CTCF-BS具有更高的突变率，在LNCaP和MCF7中分别高1.34和1.25倍 。特别地，P-CTCF-BS突变富集不是由位置特异性效应驱动，仅部分受到乘客突变的影响。

接下来，研究团队在LNCaP和MCF7细胞中评估了CTCF-INSITE的性能，发现 其预测的P-CTCF-BS突变率与实验定义的P-CTCF-BS突变率相当，且稳健性较强 。此外， 染色质环锚点共定位和高CTCFChIP-seq结合强度这两个特征与高突变率相关 。上述结果表明，乳腺癌和前列腺癌中的这些热点可能主要由P-CTCF-BS驱动。

为进一步了解P-CTCF-BSs在癌症中的功能重要性，研究团队检测了P-CTCF-BSs和L-CTCF-BSs中功能性突变的富集情况，并使用ChIP-seq数据或等位基因特异性基序评分差异（Δscore）评估了CTCF结合的变化（图3）。结果显示， |Δscore|≥2的突变是定义“破坏性”突变的适当临界值，如果ICGC突变导致|Δscore|≥2，就将其归类为“破坏性”突变 。在P-CTCF-BSs亚群中，共鉴定出40.4%的破坏性突变，而在L-CTCF-BSs中仅鉴定出26.5%的破坏性突变。

为证明基序评分能准确预测CTCF结合亲和力的破坏，研究团队使用重组截短CTCF蛋白（编码DNA结合结构域）进行了荧光极化DNA结合（FPDB）体外实验。结果显示， 与L-CTCF-BSs相比，P-CTCF-BSs在前列腺癌和乳腺癌中都富含破坏性突变和染色质环锚定位；27%被破坏的CTCF-BS具有潜在功能 ，其同样位于环锚上；预测具有破坏性的候选P-CTCF-BSs突变降低了CTCF结合。值得注意的是，相较L-CTCF-BSs， P-CTCF-BSs中功能性突变的富集程度更高，表明其在癌症的3D基因组失调中起着重要作用 。

研究团队汇编了乳腺癌和前列腺癌中突变P-CTCF-BS上下游1kb范围内的基因，并进行了基因集富集分析。结果显示， 在乳腺癌中富集了紫外线照射（UV）后下调基因，而在前列腺癌中富集了与上皮细胞-间质转化相关的基因 。这些结果表明， P-CTCF-BS突变导致CTCF结合缺失，从而导致癌症相关基因失调。

最后，研究团队评估了所观察到的P-CTCF-BSs突变富集是否是一种泛癌现象；收集了来自ICGC不同癌症队列WGS的简单突变，进行质量控制排除微卫星不稳定的癌症数据，并根据起源组织将队列中的突变分为12种癌症类型。研究团队还整理了每种癌症类型的ENCODE CTCF ChIP-seq数据，并使用CTCF-INSITE预测前10%持久性最强的CTCF-BSs，用于泛癌症富集分析。

结果表明， 不同癌症类型的CTCF-BSs内的突变率有很大差异，但所有癌症的P-CTCF-BS突变率均显著高于L-CTCF-BS 。有趣的是，P-CTCF-BS突变的发生率与总体突变负荷无关。此外， 在大多数癌症类型中，P-CTCF-BSs也显示出破坏性突变的显著富集 ，这与我们在乳腺癌和前列腺癌中的观察结果类似。上述发现证实， P-CTCF-BSs是泛癌背景下的突变热点 。

图4.P-CTCF-BS是泛癌突变热点

综上所述，研究团队开发了一种机器学习工具CTCF-INSITE，可预测P-CTCF-BSs，提供有关癌症病因学的新生物学见解；并证实P-CTCF-BSs是癌症中的突变热点，这些突变可使癌细胞具有生存优势，使其能够增殖和扩散。这一重要研究发现有潜力引领癌症诊断和治疗领域的一次革命，或将为医生们提供早期发现癌症的新手段，并为多种癌症类型带来有效的新治疗方法，显著提高癌症患者的生存质量和生存率。