干货：细胞培养保姆级实战攻略
细胞是生物细胞学实验的基础，药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。而细胞培养，受人员操作和环境条件的影响比较大，在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题，而每个问题都有可能导致细胞培养的失败。我们汇总了细胞实验室多年来的细胞培养经验分享给大家，希望能给大家的细胞培养提供参考。
我们之所以选定某种细胞系开展实验，是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性，疾病特性，功能特性，基因表达特性等。一旦用错了细胞株，对我们研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。
而近年来，多个权威机构发现细胞系在培养和流通过程中，出现了很严重的交叉污染。据不完全统计，单就HeLa细胞系导致的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题，而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个权威机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞完全吸收，在所检测细胞中污染占比46%，可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此，做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株，最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。
目前，STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一，是ATCC等权威机构认定的金标准。不过可惜的是并非所有细胞均可进行STR鉴定，目前只有大部分的人源细胞株和45个种类的小鼠细胞株可以进行鉴定。其他细胞株可以结合细胞形态、特性和物种鉴定来进行确认。
根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件，以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。
图源：https://www.51xxziyuan.com/53/10434.html
1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）
2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）
3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。
4）使培养瓶倾斜， 吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。
PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。
5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。
6）加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。
7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。
3.悬浮细胞传代：
因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。
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1）直接传代时，静置5-10分钟，待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培养液，补足新鲜的含血清完全培养液，混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，轻轻摇晃混匀。
2）离心传代时，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。
3）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
4.贴壁悬浮混合型细胞传代：
先将悬浮的细胞收集，再参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集，一起接种到培养器皿中。
PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高，培养中最好参考指南控制好细胞密度，不能过密也不能过稀。
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1）按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。
2）加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的完全培养液），使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml，移入细胞冻存管中。
3）程序降温（以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例）：4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）
6.细胞复苏：
1）取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（通常2min内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。
PS：干冰运输的冻存细胞，收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。
2）转移到无菌操作 台，75%酒精擦拭冻存管外部。
3）将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清完全培养液离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清。
4）重新加入经预热的含血清完全培养液重悬细胞，以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。
5）放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
03
污染防治
1.细菌污染
细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。
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左边的就是比较典型的杆菌污染，一般杆菌会延轴向快速游动，量少时培养基澄清。右图是颗粒状污染，一般培养基会浑浊或有白色沙状沉淀。
好氧菌增殖分裂迅速，感染24h内即可使培养基浑浊；厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢，需要较长时间才会观察到浑浊现象。
污染处理： 由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥，所以出现污染后加双抗（青霉素&链霉素，Penicillin + Streptomycin）一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周，效果相对还不错。
2. 真菌污染
细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左边这张是比较典型的霉菌污染的图片，右图是酵母污染，镜下可以看到明显的出芽形态。
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支原体的预防与清除： 由于支原体无法在镜下直接看到，需要通过PCR法等进行检测才发现，出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检，做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检，直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理，优先处理“支原体阴性”细胞，后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。同时，新引进的细胞系都进行支原体检测，确保不给实验室带来新的污染。
4.实验室细胞污染防治
建立良好的规章制度对减少细胞污染会有很大的帮助。包括准入制度、操作规范和日常管理制度。
准入制度： 包括了人员的和物料的。人员需要进行培训之后才能自己进行操作，而且要符合穿戴要求才能进实验室，如白大褂、隔离服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品应严格消毒灭菌，而购买的物品需要从正规的、可靠的渠道购买。新买的细胞应检测验证后再使用。
4.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
5.冷冻管应如何解冻？
将冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？
现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO除去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
细胞培养用液
7.如何正确选择培养基种类？
引用几款比较经典的培养基举例：
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8.如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首选 MEM 做粘附细胞培养，RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始。
9.什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
10.细胞培养基的配制和储存应该注意什么？
细胞培养基配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃培养箱内放置24~48h，已检测培养液是否有污染，然后方可用于实验。配置培养基所需的血清要合格并且保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整pH值较容易。每次配液量以使用两周左右的量为宜，一次配液不要太多，一是短期内用不完造成营养成分损失需要补充，二是量大易造成污染。
11.为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏紫色？
12.什么情况下用到无血清培养基？
对于应用培养细胞进行分离制备细胞生长因子、单克隆抗体等应该选择无血清培养基。
13.如何选择正确的血清种类？
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14.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
15.血清灭活是否必须？
一般情况下不建议。热灭活是以 56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有：溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多， 这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是 "小黑点"，常常会让研究者 误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37C 环境中，又会使此沉淀 物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。因此除了做免疫学相关实验和培养一些特定细胞，如平滑肌细胞、胚胎干细胞等，不需要做热灭活处理。
16.培养基中是否添加抗生素？
除特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
17.何时更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。
细胞传代
18.细胞传代的方法都有哪些？
根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
19.原代培养的首次传代应注意的问题？
细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代；原代培养时细胞多为混杂生长，不同的细胞有不同的消化时间，因此要根据需要注意观察及时处理，并根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间而分离和纯化所需要的细胞；
吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤；首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增值；随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。
20.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？应如何处理？
EDTA作用较胰蛋白酶缓和，主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。常用比例为1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在终止消化前，需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成胰蛋白酶的活性降低，并可减少污染的机会。
21.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为800~1000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。
22.细胞的接种密度为何？
依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。
23.细胞交叉污染的可能原因？
多种细胞系进行维持传代操作时，各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。
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24.冷冻培养基为什么要加DMSO？
因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将造成细胞损伤，还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高包膜对水的通透性。
25.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？
冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。
26.欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
27.冷冻保存细胞的方法？
冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 长期储存。
冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
28.细胞冻存太多会不会浪费？
每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止由于细胞污染等因素造成的细胞系的绝种，而且每一批次培养的细胞状态都不同，应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或者发生改变
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