不同检测标志物在宫颈腺癌中的诊断和预后预测价值评估

宫颈癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤之一，其病理类型主要包括鳞状细胞癌 ( 简称鳞癌 ) 和腺癌。近年来，宫颈腺癌的发病率逐年增加，在宫颈癌中的占比 ≥20% ，年轻女性中宫颈腺癌的发病率高于一般女性人群。高危型人乳头瘤病毒 (high － risk human papillomavirus, HR － HPV) 与宫颈鳞癌发生的密切关系已得到证实，而 HPV 与宫颈腺癌的病因学关系尚存在争议。目前，用于病变组织中 HR － HPV 检测的方法主要有全组织切片聚合酶链反应 (whole tissue section － polymerase chain reaction, WTS － PCR) 和 HR － HPV mRNA 原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 。但 HR － HPV 的 WTS － PCR 检测包含肿瘤组织和非肿瘤组织，无法准确判断 HR － HPV DNA 的来源以及其是否有转录活性，导致目前相关研究中宫颈腺癌的 HPV 阳性率差异较大。激光显微切割 (laser capture microdissection, LCM) 技术可以利用激光精准定位肿瘤组织或者肿瘤细胞，避免癌旁组织中 HPV 的干扰。尽管 HR － HPV 的 LCM － PCR 检测更精准，但操作复杂、价格昂贵，而 E6/E7 mRNA ISH 操作简便，可以直观反映肿瘤组织中的 HPV 感染状态，从而辅助形态学分类。在本研究中，我们分别检测了 54 例宫颈腺癌的 HR － HPV DNA 、 E6/E7 mRNA 和 p16 ，评估了不同辅助诊断技术对宫颈腺癌的诊断效能和不同标志物对患者预后的影响。

资料与方法

1 ．研究对象：

纳入标准：(1)经活检或术后病理诊断为宫颈腺癌；(2)有完整原始诊断记录；(3)宫颈活检或手术标本(蜡块)大小合适，固定良好，符合重新切片要求(直径<2 cm，厚度>2 mm)；(4)有完整随访记录。排除标准：(1)病理诊断腺鳞癌、原位腺癌；(2)肿瘤组织退变严重或固定不佳等。纳入2005—2010年中国医学科学院肿瘤医院符合入组条件的宫颈腺癌患者54例作为研究对象，年龄为(47.9±15.1)岁。本研究获得了中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准(批准号：CH－HPV－02)。

2 ．组织标本和切片方法：

54例宫颈腺癌患者的组织标本中，24例为手术标本，30例为活检标本。将患者的组织蜡块行三明治切片，第1张和最后1张4 μm蜡卷用于HE染色，中间3个5 μm蜡卷用于HR－HPV E6/E7 mRNA检测，1张4 μm切片用于p16免疫组化染色，2张4 μm用作免疫组化染色备份，3个8 μm蜡卷用于WTS－PCR检测，1个4 μm蜡卷用于LCM－PCR检测，1张4 μm切片用于备份。

3 ．免疫组化染色：

采用柠檬酸盐缓冲液高压加热抗原修复法，按照试剂说明书进行操作。p16一抗为鼠单克隆抗体，购自美国Lab Vision公司。Dako EnVisionTM FLEX显色剂购自丹麦Dako公司。p16定位于细胞核和细胞质。结果判读标准：>70%的肿瘤细胞着色且表现为强阳性时判读为阳性。

4 ．宫颈腺癌的病理诊断和分类：

由病理医师通过对HE染色切片的镜下观察，并结合p16免疫组化染色结果，根据2018年国际宫颈腺癌标准和分类(International Endocervical Adenocarcinoma Criteria and Classification, IECC)进行分类。若在40~100倍显微镜下有易见可识别的核分裂象和凋亡小体则为HPV相关性腺癌(human papillomavirus associated adenocarcinoma, HPVA)，若在高倍镜下不可见核分裂象和凋亡小体则为非HPV相关性腺癌(non－human papillomavirus associated adenocarcinoma, NHPVA)。然后，根据形态学特征对HPVA和NHPVA进一步划分，其中HPVA包括普通型、浸润性复层上皮分泌黏液的癌(invasive stratified mucin－producing carcinoma, ISMC)、肠型、印戒细胞型和黏液腺癌非特指型(not otherwise specified, NOS)，NHPVA包括胃型、透明细胞型、中肾管型、宫内膜样癌、浆液腺癌和腺癌NOS。

5 ．WTS －PCR 检测HR －HPV DNA ：

向装有组织蜡卷的EP管中加入蛋白酶K溶液250 μl，70 ℃孵育24 h，间隔性振荡EP管使组织充分消化。最后，95 ℃金属浴10 min使蛋白酶K失活，离心收集DNA。采用SPF10－DEIA－LiPA25体系对提取的DNA进行分型检测，其中SPF10探针能够扩增54种不同型别的HPV，DEIA即DNA酶联免疫吸附法，LiPA25为可区分25种HPV型别(HPV6、11、16、18、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、66、68/73、70和74)的线性探针检测。DEIA检测阳性的标本进行LiPA25分型检测，而DEIA检测阴性标本，经10倍稀释后再次行PCR扩增和DEIA检测，以排除PCR抑制导致的假阴性。

6 ．LCM －PCR 检测HR －HPV DNA ：

将蜡卷制成特殊膜片，苏木素染色，应用美国Aperio数字切片扫描仪进行扫描，由病理医师在扫描图像上标记显微切割的腺癌范围，根据标记范围进行激光切割。收集切割下来的所有病变组织，按照WTS－PCR中的检测方法进行HR－HPV检测。

7 ．E6/E7 mRNA ISH ：

将蜡卷进行脱蜡和固定处理后，应用RNAScope FFPE2.5试剂盒(美国Advanced Cell Diagnosis公司)，按照试剂盒说明书进行操作，经过杂交、洗脱、6步信号放大、反染、脱水和封片后进行mRNA信号检测。评分标准：0分：每10个细胞的染色点为0个信号点；1分：1~3个信号点；2分：4~10个信号点，非常少的簇状点；3分：>10个信号点，具有簇状点的阳性细胞≤10%；4分：>10个信号点，具有簇状点的阳性细胞>10%；评分≥1分为阳性。此方法可检测18种HR－HPV的E6/E7 mRNA，包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82，但不区分具体型别。

8 ．随访：

从手术之日或参加"中国妇女子宫颈腺癌HPV型别分布：以医院为基础的多中心研究"项目起对患者进行随访，主要采用电话、短信或者复查的方式进行。平均随访时间为35.9个月(95% CI ：28.0~43.9个月)，随访终点为肿瘤复发或死亡。5年的随访率为100%。

9 ．统计学方法：

应用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计数资料组间比较采用 χ ² 检验，两种检测方法的一致性分析采用 Kappa 检验，标志物诊断效能的评价进行受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析，曲线下面积(area under curve, AUC)的比较采用Delong检验，生存分析采用Kaplan－Meier法，组间生存率的比较采用Log rank检验，多因素生存分析采用Cox比例风险模型。检验水准α＝0.05。

结  果

1 ．患者的临床病理特征：

54例宫颈腺癌患者中，HPVA 30例，NHPVA 24例。HPVA和NHPVA患者的发病年龄、首次性交年龄、肿瘤最大径、分化程度、国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期、宫旁受累和辅助治疗情况差异均无统计学意义(均 P >0.05，表1)。

2 ．WTS －PCR 和E6/E7 mRNA ISH 的检测结果：

WTS－PCR检测结果显示，54例宫颈腺癌患者的HR－HPV DNA阳性率为68.5%(37/54)，其中HPVA患者的HR－HPV DNA阳性率为96.7%(29/30)，NHPVA患者的HR－HPV DNA阳性率为33.3%(8/24)，差异有统计学意义( χ ² ＝24.79， P <0.001)。E6/E7 mRNA ISH检测结果显示，宫颈腺癌患者的HR－HPV E6/E7 mRNA阳性率为35.2%(19/54)，其中HPVA患者的HR－HPV E6/E7 mRNA阳性率为63.3%(19/30)，NHPVA患者的HR－HPV E6/E7 mRNA阳性率为0(0/24)，差异有统计学意义( χ ² ＝23.45， P <0.001)。两种检测结果一致性一般( Kappa ＝0.399, P <0.01；表2)。

3 ．WTS －PCR 、E6/E7 mRNA ISH 与LCM －PCR 检测结果的比较：

采用随机数字法，从37例WTS－PCR HR－HPV DNA阳性的患者中选取15例进行LCM－PCR检测，其中HPVA 11例，NHPVA 4例。结果显示，5例HR－HPV DNA阳性，10例阴性。WTS－PCR与LCM－PCR检测结果的阳性一致率为33.3%。E6/E7 mRNA ISH与LCM－PCR检测结果比较，一致性较强( Kappa ＝0.842， P ＝0.001；表3)。

4 ．宫颈腺癌组织中p16 表达及其与WTS －PCR 、E6/E7 mRNA ISH 检测结果的关系：

免疫组化检测结果显示，宫颈腺癌中p16的阳性率为62.9%(34/54)，其中HPVA和NHPVA的p16阳性率分别为80.0%(24/30)和41.7%(10/24)，差异有统计学意义( χ ² ＝8.64， P ＝0.003)。HR－HPV DNA(WTS－PCR检测)阳性和阴性的宫颈腺癌患者中p16的阳性率分别为81.1%(30/37)和23.5%(4/17)，差异有统计学意义( χ ² ＝16.54， P <0.001)。HR－HPV E6/E7 mRNA阳性和阴性的宫颈腺癌患者中p16的阳性率分别为94.7%(18/19)和45.7%(16/35)，差异也有统计学意义( χ ² ＝12.69， P <0.001；表4)。

5 ．HR －HPV DNA(WTS －PCR 检测) 、HR －HPV E6/E7 mRNA 和p16 表达鉴别HPVA 和NHPVA 的效能评价：

ROC曲线分析显示，HR－HPV DNA鉴别HPVA和NHPVA的AUC为0.817(95% CI: 0.692~0.942)，灵敏度为96.7%，特异度为66.7%。HR－HPV E6/E7 mRNA鉴别HPVA和NHPVA的AUC为0.817(95% CI: 0.701~0.932)，灵敏度为63.3%，特异度为100.0%。p16表达鉴别HPVA和NHPVA的AUC为0.692(95% CI: 0.546~0.838)，灵敏度为80.0%，特异度为58.3%(图1)。DeLong检验表明，HR－HPV DNA鉴别HPVA和NHPVA的AUC高于p16表达( z ＝2.02， P ＝0.044)，但与HR－HPV E6/E7 mRNA差异无统计学意义( z <0.01， P ＝1.000)，HR－HPV E6/E7 mRNA鉴别HPVA和NHPVA的AUC与p16表达差异亦无统计学意义( z ＝1.88， P ＝0.060)。

6 ．宫颈腺癌的预后影响因素分析分析：

54例宫颈腺癌患者的1、3和5年生存率分别为76.7%，66.0%和57.4%。其中，NHPVA患者的1、3和5年生存率分别为69.0%、55.0%和47.0%，HPVA患者分别为84.0%、76.0%和66.0%，两组比较差异无统计学意义( χ ² ＝2.90， P ＝0.08；图2)。HR－HPV DNA(WTS－PCR检测)阳性与阴性患者的生存率差异无统计学意义( χ ² ＝2.01， P ＝0.156；图3)。HR－HPV E6/E7 mRNA阳性与阴性患者的生存率差异有统计学意义( χ ² ＝10.81， P ＝0.001；图4)。p16阳性患者与阴性患者的生存率差异有统计学意义( χ ² ＝4.30， P ＝0.038；图5)。

纳入发病年龄、肿瘤最大径、分化程度、FIGO分期、宫旁受累、宫颈腺癌类型、p16、HR－HPV DNA(WTS－PCR检测)、HR－HPV E6/E7 mRNA和术后辅助治疗等作为自变量进行多因素Cox比例风险模型回归分析，结果显示，FIGO分期( HR ＝19.875，95% CI ：1.526~258.833)和宫旁受累( HR ＝14.032，95% CI ：1.281~153.761)是宫颈腺癌患者预后的独立影响因素(表5)。

讨  论

在IECC分类标准中，宫颈腺癌分为HPVA和NHPVA。HPVA通常在高倍镜下可观察到肿瘤腺体内有明显的核分裂和凋亡小体，而NHPVA无这一特征。HPVA中HR－HPV DNA的阳性率超过90%，通常p16阳性，而NHPVA中HR－HPV DNA和p16常为阴性。p53在超过50%的胃型腺癌中呈突变型表达。此外，作为鉴别宫颈和宫内膜腺癌的标志物，PR和vimentin在子宫内膜样癌中常有表达，但在其他类型腺癌中几乎不表达。与HNVA患者相比，NHPVA患者的发病年龄一般更晚，肿瘤体积更大，分化更差，临床分期更晚，预后也较差，复发率更高。

有研究表明，宫颈腺癌总体的HR－HPV DNA阳性率为60%~88%，但在这些研究中均采用WTS－PCR技术进行检测。在本研究中，采用WTS－PCR方法检测宫颈腺癌患者的总体HR－HPV DNA阳性率为68.5%，而HPVA和NHPVA阳性率分别为96.7%和33.3%。从HR－HPV DNA阳性标本中选取15例，使用LCM－PCR方法精准获取全组织切片中的腺上皮病变区域，排除了其他病变区域和正常组织中HPV的干扰，结果显示，只有5例HR－HPV DNA阳性。WTS－PCR和LCM－PCR检测结果的差异可能源于宫颈腺癌组织周围存在被HPV感染的鳞状上皮，因此WTS－PCR检测HPV DNA在宫颈腺癌中的应用受到了限制。

在HR－HPV持续感染宿主的情况下，病毒基因整合至宿主基因组后表达E6/E7蛋白，二者分别结合细胞周期调节蛋白p53和pRb，使宿主细胞中的肿瘤抑制通路出现障碍，从而导致部分蛋白异常表达，引发细胞周期紊乱，使细胞发生癌变。尽管E6/E7基因转录活性增强被认为是评估HPV转化感染的金标准，但由于缺乏可靠、经过验证的E6/E7免疫组化抗体，该标志物的临床应用受到限制。RNAscope ISH方法有特异的双"Z"探针设计和特异目标信号放大功能，可以精准捕获E6/E7 mRNA分子，并通过显微镜下观察确定病变组织和细胞中HR－HPV E6/E7 mRNA的空间分布情况。在本研究中，我们采用E6/E7 mRNA ISH方法检测的结果显示，HPVA中E6/E7 mRNA阳性率为63.3%，NHPVA中却均为阴性。与15例宫颈腺癌患者的LCM－PCR检测结果相比，仅1例不一致( Kappa ＝0.842， P ＝0.001)。这与Luo等报道的结果(区分HPVA的灵敏度和特异度分别为75.8%和80.0%)相似。

p16作为一种细胞周期蛋白，通常在HPV感染的细胞中过表达，阻断细胞从G ₁ 期向S期进展，导致细胞周期紊乱，并且p16蛋白表达强度随宫颈病变程度的加重而增强。目前，p16已作为宫颈鳞状上皮病变是否存在HPV感染的标志物。在宫颈鳞癌中，p16的阳性率约为95%。由于宫颈腺癌组织类型较多、与宫颈鳞癌的发病机制存在差异，p16在宫颈腺癌中的表达意义不能完全等同于宫颈鳞癌。Stolnicu等对297例浸润性腺癌的免疫组化检测显示，胃型和透明细胞型腺癌中p16阳性率分别为33%和17%。本研究结果显示，HPVA和NHPVA的p16阳性率分别为80.0%和41.7%，HR－HPV DNA阳性和阴性患者中p16阳性率分别为81.1%和23.5%，差异均有统计学意义。HR－HPV E6/E7 mRNA阳性患者中p16阳性率为94.7%，35例HR－HPV E6/E7 mRNA阴性患者中有16例(45.7%)p16阳性，而这16例中有12例为HR－HPV DNA阳性，仅有4例为HR－HPV DNA阴性，更加证实尽管宫颈癌与HPV感染是引起p16蛋白过表达的主要因素，但不是唯一因素，一些NHPVA也会出现p16表达。在IECC中，p16检测对于HPVA的诊断并不是必须的，但在罕见型宫颈腺癌中可作为有效的辅助诊断指标用于病理分类。

有研究表明，发病年龄、FIGO分期、肿瘤大小、分化程度、术后辅助治疗、淋巴血管侵袭、宫旁受累和E6/E7 mRNA表达等因素是宫颈腺癌患者预后的独立影响因素。在一些HPV作为高危因素的疾病中，如宫颈癌和口咽癌等，HPV阳性患者的预后优于HPV阴性患者。p16可作为宫颈腺癌患者预后预测的生物标志物，p16阳性患者的无进展生存率和总生存率优于阴性患者。FIGO分期( HR ＝19.875，95% CI ：1.526~258.833)和宫旁受累( HR ＝14.032，95% CI ：1.281~153.761)是宫颈腺癌患者的独立预后指标，而HR－HPV DNA(WTS－PCR检测)、HR－HPV E6/E7 mRNA和p16表达均非宫颈腺癌患者的独立预后指标。

本研究的主要不足之处在于纳入的宫颈腺癌患者数量较少，且未对全部HR－HPV DNA阳性标本进行LCM－PCR检测。

总之，HPV E6/E7 mRNA能直观判断宫颈腺癌组织中是否存在HPV转化感染，并能反映宫颈腺癌组织中HPV的分布特征。HR－HPV E6/E7 mRNA与HR－HPV DNA(WTS－PCR检测)鉴别HPVA和NHPVA的效能相近，HR－HPV DNA的灵敏度较高，而HR－HPV E6/E7 mRNA的特异性较高，HR－HPV DNA鉴别HPVA和NHPVA的效能优于p16表达。HR－HPV E6/E7 mRNA和p16表达阳性宫颈腺癌患者的生存率均优于阴性患者。