肿瘤免疫前沿中的微流控技术
针对免疫检查点（ 如PD-1、CTLA-4 ）癌症免疫治疗的临床成功开创了癌症治疗的新时代。然而，免疫治疗固有的和后天的耐药性限制了患者的受益和更广泛的应用。对免疫治疗反应和抵抗机制的研究已经证实了关键的肿瘤内在和外在因素，研究多种细胞类型的复杂相互作用对于理解癌症治疗的反应和耐药性机制十分关键。
但是，缺乏能够真实再现肿瘤微环境（ TME ）关键特征的模型系统仍然是癌症研究者面临的一个挑战。近年来，患者源性肿瘤模型的出现，促进了肿瘤免疫动力学的研究。微流控技术使微物理系统（ MPS ）的发展成为可能，用于评估肿瘤微环境，在研究肿瘤免疫动力学方面显示出良好的应用前景。进一步开发基于微流控的“芯片上肿瘤”的MPS来研究肿瘤-免疫相互作用可能会克服目前肿瘤免疫学面临的几个关键挑战。
肿瘤在TME中形成和发展，TME不仅包含肿瘤细胞，还包含基质细胞和免疫细胞。 肿瘤的发生和发展既受肿瘤内遗传或获得性突变的影响，也受肿瘤周围TME中多种成分的相互作用的影响，包括细胞、信号因子和支持性结构分子。 值得注意的是，肿瘤异质性存在于不同患者之间、同一患者的不同病变内以及单个肿瘤的不同区域。 在TME中存在的免疫和基质成分中也观察到这种异质性。 更重要的是，这种异质性随着时间的推移是动态的。
肿瘤微环境是细胞和非细胞成分的高度异质性混合物，包括成纤维细胞、细胞外基质（ ECM ）、间充质基质/干细胞（ MSCs ）、血管系统、平滑肌细胞、免疫细胞、神经和信号因子。在TME的背景下，随着单细胞RNA测序、质谱仪和多参数成像等技术的发展，分析了TME的复杂性和多样性及其对治疗反应的影响。
根据免疫成分和状态，TME被分为三种类型，包括浸润-排斥、浸润-炎症和浸润-三级淋巴结构（ TLS ）。浸润-排斥TME的特征是细胞毒性T细胞（ CTL ）排斥在肿瘤核心外，CTL定位于肿瘤周围。浸润-炎症TME的特征是肿瘤细胞和髓系细胞上大量表达PD-L1，CTL高度激活，表达颗粒酶B、IFN-γ和PD-1。浸润-TLSTME含有TLS，其免疫细胞成分与淋巴结类似，包括B细胞、树突状细胞和Treg细胞。
最近，通过分析20种不同癌症中10000多名癌症患者的转录组信息，Bagaev等人确定了四种TME亚型：免疫富集型和纤维化型（ IE/F ）、免疫富集型和非纤维化型（ IE ）、纤维化型（ F ）和免疫耗竭型（ D ）。IE/F亚型为免疫性炎症，以CAF激活和血管生成相关功能基因表达上调为特征。IE亚型高度浸润，显示T细胞活性增加。F和D亚型均缺乏或仅有少量淋巴细胞浸润。进一步的研究发现，这些TME亚型与免疫治疗的反应相关，其中具有良好免疫微环境的患者往往从免疫治疗中获益最多。
TME中复杂 的细胞相互作用影响对癌症治疗的反应和耐药性。 开发更复杂和临床相关的TME模型不仅可以提供一种可靠的方法来评估新治疗方案的疗效，还可以促进我们对肿瘤细胞和TME之间相互作用的理解，从而进一步促进有效抗癌策略的识别。 随着生物工程和动物模型的发展，已经开发出多种复杂的体内、二维和三维癌症模型。
小鼠模型可以提供一个完整的先天性和适应性免疫系统，允许在TME的影响下开发来自同基因移植或基因工程的肿瘤。同基因植入小鼠肿瘤模型仍然是研究TME和评估免疫疗法的“金标准”。通过将自发的、致癌物诱导的或转基因的肿瘤细胞系接种到近交系，如C57BL/6、BALB/c和FVB小鼠，同基因小鼠发展出与宿主免疫系统相互作用并成为免疫浸润的肿瘤。
鉴于观察到的人类和小鼠肿瘤之间的差异，研究人员开发了人源化小鼠模型，用匹配的人类肿瘤细胞和免疫细胞在免疫缺陷宿主小鼠中重建人类肿瘤-免疫系统。这些人源化小鼠为研究肿瘤-免疫细胞相互作用和评估免疫治疗反应提供了一个有好的临床前模型。然而，它们需要自体免疫重建，并且免疫重建的持续时间相对较短，限制了它们的广泛应用。尽管这些模型并不完美，但它们已经在评估植入人体肿瘤组织的治疗效果方面取得了巨大进展。
基于永生化细胞系的传统2D培养系统由于其低成本和高通量的能力，已被癌症生物学家广泛用于研究肿瘤生物学和测试抗癌疗法，尤其是研究作用机制。
然而，当从肿瘤块中分离细胞，然后在2D条件下（ 塑料瓶或培养皿 ）培养时，细胞失去了细胞-细胞和细胞-细胞外环境的相互作用，这对其生理功能至关重要，如细胞分化、基因表达和对刺激的反应。此外，细胞形态和细胞极性也会发生变化。
2D培养系统的另一个缺点是缺乏肿瘤微环境的复杂性和异质性，使其成为研究复杂癌症生物学和试验临床前药物的较不可靠的模型系统。
3D肿瘤模型越来越多地用于更真实地再现体内观察到的生物学。3D肿瘤模型开发的核心是3D培养设备和生物材料，作为肿瘤细胞、球体或类有机物生存和生长的支架。大多数3D肿瘤模型使用从动物或植物中纯化的天然生物材料，这些材料可以被肿瘤和/或基质细胞酶消化。3D肿瘤模型中常用的天然生物材料包括胶原蛋白、明胶、基质凝胶、水凝胶、壳聚糖、海藻酸钠、蚕丝、聚ε-己内酯（ PCL ）和透明质酸。这些生物材料可单独使用或组合使用，并应用于培养细胞或球体。
通过集成3D培养系统和生物材料，已经开发出多种3D培养模型，包括球体、类器官和3D生物打印，并应用于各种类型的癌症。多细胞肿瘤球体（ MTS ）由多个自组装成3D球形结构的癌细胞组成。因此，它们可以在3D环境中捕捉细胞相互作用，并可以维持特定的细胞形态，以及模拟类似于体内条件的代谢和增殖梯度。
类器官是通常由干细胞或祖细胞产生的3D细胞簇，嵌入细胞外基质中，自发形成器官样或组织样结构。它们可以扩展用于长期培养，保存原始组织的组织学和遗传特征，并且可以进行冷冻保存以促进长期的反复实验。由于类器官也易于遗传操作，基于类器官的3D肿瘤模型已广泛应用于许多领域，包括癌症研究。
3D生物打印是一种创新的计算机辅助工程技术，可在生理3D模型中生成包含多种细胞类型的3D组织结构。它可以有效地重现TME的关键成分，并且适合于高通量筛选或测试各种癌症模型中的药物疗效。
3D培养为评估药物疗效提供了一个更具生理相关性的环境，也为筛选潜在药物靶点提供了一个理想的系统。然而，必须强调的是，选择的平台通常由感兴趣的特定过程决定，并且特定于模型的特性可能会影响结果，因此需要进行跨模型验证。
微流控技术是一种可以操纵在数百毫米长度的通道中的微小流体（ 10 − 9 至10 − 18 L ）的技术。由于TME内的肿瘤细胞和免疫细胞的细胞体积与细胞外液体积大于1（ 即细胞外液体积更小 ），微流控装置的尺寸使其非常适合用于研究和模拟TME的生物学应用。微流控技术的另一个特点是其低雷诺系数（ Re ），这是指流体上惯性力与粘性力的比率。当Re值较低时，微流控系统中的流体流动为层流，这意味着质量主要通过扩散传递。这使得在微流控系统中在时间和空间上产生可溶性因子的浓度梯度成为可能。
微流控装置也被称为“器官芯片”或“组织芯片”，使用塑料材料或其他光学透明材料形成灌流空心微通道，可以模拟脉管系统。虽然聚二甲基硅氧烷（ PDMS ）通常用于制造微流控装置，但已经验证了几种刚性热塑性聚合物（ 例如聚碳酸酯、环烯烃共聚物 ），以克服PDMS的关键限制，例如疏水分子的吸附和蒸发。此外，随着微流控技术的发展和人们对该系统的优化，许多复杂的微流控设备已被开发用于特定功能。
通过将微流控技术与3D培养系统相结合，研究人员可以控制基质结构、基质刚度、细胞组成和比率、流速和其他特征。这些设备还可以与高分辨率实时成像结合，以探索特定器官或疾病背景下的各种临床前分析。微流控技术已广泛应用于癌症生物学和癌症免疫治疗的许多方面的研究，包括肿瘤生长、癌细胞外渗、血管生成、免疫治疗反应和药物筛选。
癌细胞的标志性特征之一是持续的增殖信号，导致细胞生长失控。3D微流控设备已被用于探索TME中不同细胞亚型和影响癌细胞增殖的因素之间的相互作用。
为了研究成纤维细胞和ECM蛋白对癌细胞生长和迁移的影响，Lugo Cintroón等人在微流控装置中将乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养。他们发现，成纤维细胞通过增加培养基中金属蛋白酶（ MMPs ）的水平促进癌细胞生长并诱导更多的迁移。
癌细胞外渗是循环中的肿瘤细胞通过血管在次要部位形成沉积的过程。微流控建模能够评估肿瘤细胞/内皮细胞的迁移和肿瘤细胞的外渗。与研究细胞迁移的传统方法（ 如transwell分析和划痕分析 ）相比，这种基于微流控的平台在介质通道中使用内皮细胞单层来模拟微血管，提供更具生理相关性的微环境，以研究癌症-血管串扰，并确定参与肿瘤细胞迁移潜能调节的因素。利用这项技术，发现了几种细胞因子，如IL-6、IL-8和MMP-3分泌水平的增加与外渗呈正相关。
血管生成对肿瘤生长特别重要。已经开发了多种基于微流控的血管生成模型，以模拟体外新血管形成的起始。其中一项研究证明了在微流控装置中重建血管生成芽，以及如何应用该模型来确定潜在血管生成抑制剂对体外芽形成的影响。
转移是一个复杂的过程，因此，研究癌症进展中这一关键步骤的潜在机制非常重要。Cho等人开发了一种具有淋巴管-组织-血管结构的三通道微流控装置，以研究炎症细胞因子在淋巴转移中的作用，并发现IL-6通过介导TME中的细胞间相互作用诱导上皮-间充质转化。
忠实地再现TME关键成分的肿瘤模型可促进预测癌症治疗敏感性的应用，为个性化或精准治疗策略铺平道路。微流控设备是此类应用的理想选择，因为TME中的多个组件可以单独控制。
例如，Jeong等人展示了一种微流控芯片，该芯片允许肿瘤球体与CAF共同培养，以监测其相互作用，为研究肿瘤细胞与CAF的串扰提供了一个平台。另一种类似的方法已被用于模拟肿瘤细胞与基质的相互作用，以及肿瘤与内皮细胞之间的相互作用。
此外，还开发了微流控装置来模拟TME的其他功能。例如，Michna等人描述了一种包含互连微通道的新平台，以模拟高度血管化系统。其他研究还侧重于开发微流控芯片以控制氧浓度。
模拟免疫细胞迁移对于理解肿瘤-免疫动态相互作用和免疫治疗反应至关重要。通过集成显微技术，可以实时监测微流控芯片模拟的细胞迁移。
许多研究利用微流控技术探索免疫细胞迁移在癌症发展中的作用。一项研究证明了含有基于管腔的血管成分的微流控系统用于研究中性粒细胞与内皮细胞的相互作用，揭示了IL-8在促进中性粒细胞趋化和启动中的关键作用。招募的中性粒细胞增加了局部活性氧（ ROS ）的产生，从而促进细胞粘附和趋化因子受体的上调。
尽管已采用多种分析方法检测T细胞活化和效应T细胞功能，但在刺激条件下实时监测3D环境中的T细胞激活更有价值。Park等人使用微流控系统监测T细胞和内皮细胞之间的相互作用，并将其应用于识别可能调节这种相互作用的潜在药物。
3D微流控技术已用于测试对ICI单独或与其他方案联合的免疫治疗反应。为了利用该系统评估免疫治疗反应，使用了多种敏感和耐药的同源模型来验证该系统的稳健功能。
应用这种策略，Deng等人发现CDK4/6抑制剂和PD-1阻断剂的组合通过促进T细胞浸润和活化来提高治疗效果。同时，Sade Feldman等人进行了scRNA序列分析，并定义了两种不同的CD8+T细胞状态，即CD8+CD39−TIM3−和CD8+CD39+TIM3+，可作为检查点免疫治疗成功或失败的预测指标。
疾病和治疗反应监测是作出临床决定和预测所必需的。许多微流控设备已经适应了这些领域的功能。目前，CellSearch设计的微流控装置已获得FDA批准，用于预测预后，评估患者的无进展生存率和总生存率。该设备利用靶向EpCAM的抗体包被磁粉检测和量化转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者全血中上皮来源的循环肿瘤细胞（ CTC ）。
除CTC外，一些免疫亲和微流控装置已用于捕获液体活检中的外泌体。其中一个来自ExoSearch，利用微流控装置中的浓缩血浆外泌体，免疫磁珠可用于捕获和测量外泌体肿瘤标记物（ 如CA-125、EpCAM和CD24 ）。由于一些外泌体已被证明会抑制抗肿瘤免疫，因此有希望监测外泌体上的免疫治疗反应相关标记物（ 如PD-L1 ）以预测ICI疗效。
目前，人们对开发3D肿瘤模型以改进癌症药物开发的兴趣越来越大。基于微流控技术的药物检测能够减少所需试剂的体积，并且可以适应并行化和潜在的自动化。
尽管大多数基于微流控设备的药物筛选应用都处于概念验证阶段，但有几个小组已经尝试开发微流控系统来进行药物筛选。例如，Bhise等人通过3D打印技术开发了一个芯片肝脏平台，使用肝脏球体作为材料源，将肝脏组织直接打印到微流控设备中。作者进一步证明，生物打印的肝球体可以在设备中长期培养，并用作药物毒性测试平台。
癌症治疗在过去十年中取得了长足的进步，尤其是靶向治疗和免疫治疗的应用，但固有和获得性耐药性仍然是一个持续的挑战。 关于肿瘤和TME的异质性以及肿瘤-免疫相互作用的动态性质仍然需要进一步研究。 此外，随着多种联合疗法、新的生物标记物和抑制性受体被提出来指导我们的诊断、预后和治疗方法，需要更复杂的临床前模型来提供可靠的功能应用和更有效的评估。
微流控设备的使用保持了患者肿瘤准确的生理性和特征，三维培养与微流控技术相结合来模拟肿瘤-免疫动力学以评估药物疗效，有可能减少药物开发的时间和成本。此外，微流控设备可以进行多组学研究和实时成像分析，这将有助于研究肿瘤-免疫相互作用和抗药性机制，以及识别和评估新型癌症治疗方法。综上所述，肿瘤微环境的微流控建模有望被纳入临床实践，以推进癌症免疫治疗和精确医学。
1.Going with the Flow: Modeling the Tumor Microenvironment Using MicrofluidicTechnology. Cancers (Basel). 2021 Dec; 13(23): 6052.
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